大片段DNA的测序: 通过鸟枪法 (Shot Gun Sequencing) 测序 鸟枪法测序的操作方法 1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。 2. 对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段 DNA进行末端平滑化。 3. 进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的 3'端加上一个A碱基。 4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。 5. 对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。 6. 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。 DNA测序量 应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率)，对每个反应的有效测序长度定义为600 Bases。 如：对100 kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：

有时候提DNA不是很顺，所以提出来大家讨论一下，因为我是做微生物的，我首先提供一下关于微生物的DNA 提取方法，大家觉的有可以改进的地方，欢迎讨论！！ 细菌DNA的提取 ： （一）试剂： 1. 抽提缓冲液 2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) （去色素） 100 mM Tris-HCl (pH8.0) 25 mM EDTA (pH8.0) 2.0 M NaCl 2. 10 M LiCl 3. 2 M LiCl 4. DEPC-water（抑制RNA酶活性） 5. 3 M NaAc (pH5.2) 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇 步骤： 1. 抽提缓冲液65 ℃预热； 2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700 ul）中混匀，65 ℃，10 min； 3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000 rpm，10 min； 4. 取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000 rpm，10 min； 5.

近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对开矿学延伸。通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要， 结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。 一、石蜡包埋组织DNA提

1 DNA提取 ⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml，以ACD（柠檬酸纳缓冲液）1/7体积抗凝； ⑵ 3500rpm 15分钟离心，吸除上层血浆； ⑶ 加5倍体积蒸馏水（灭菌），摇匀，静置5~10分钟，3500rpm15分钟离心，去上清，（若沉淀不够，可重复1~2次）； ⑷ 吸取沉淀（少许液体）放入1.5ml离心管，STE 清洗2次；12000rpm 7~8分钟离心； ⑸ 去上清后加0.5mlSTE，10%SDS 25~30ml，蛋白酶-K 5μl（100μg/ml）37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止； ⑹ 等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；勿吸入蛋白层； ⑺ 上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：10），倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管； ⑻ 上清液加等体积氯仿：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上清入另一管； ⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇；应出现白色絮状物（DNA）；于-20℃放置2

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素  复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。  抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+  多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段  P/E 启动子/增强子  Terms 终止信号  加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点

二．多选题 1 ．重组连接时，反应体系必须的组分有（ A 、C ） A ．Mg2+ B. BSA C. ATP D. PO4 3- E . EDTA 2 ．DNA 片段重组连接可用下列哪些方法（A 、B 、C 、D 、E ） A ．平末端连接 B. 粘末端连接 C. 加接头连接 D. 同聚尾连接 E . T 载体连接 3 ．酚抽提法回收DNA 片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（A 、C ） A ．酚 B. 微量的EB C. 琼脂糖 D. 少量的乙酸钠 E . 少量的乙醇 4 ．产生平末端的方法主要有（A 、B 、E ） A ．用产生平末端的限制酶切 。 B ．用klenow 片段补齐5 ‘粘末端。 C ．用末端转移酶补齐粘末端。 D ．用Taq 聚合酶补齐粘末端。 E ．用S1 核酸酶降解粘末端。 5 ．在DNA

最糟糕的心态 - 实验失败了，抱怨试剂不好。实验人员本来是应该拥有修正主义、机会主义、怀疑论等诸多“不完美的”意识，所以一定要用“完美的”自我批评意识来平衡。我为什么没有一双慧眼选择可靠的供应商？我为什么不做预实验检测所购试剂？ 最糟糕的知识 - RNase A 的作用。RNase A 是内切酶，内切酶的作用结果是产生片段，而不是单个核苷酸，所以，RNase A 作用于 RNA 的结果是：大的 RNA 变成小的 RNA。为什么不同批次或者不同公司的 RNase A 消化 RNA 的结果不一样呢？因为 RNase A 的纯度不同：RNase A 纯度越高，则RNA 残留的片段就越大！事实上，RNase 的粗制品去除 RNA 的效果是最彻底的，但现在几乎没有公司销售了，可能的原因，一是生产粗制品成本更高，二是其中的杂质可能对 DNA 的完整性有影响。 最糟糕的试剂 - 水。水是所有实验都必须用到的试剂，但却没有人将她当做试剂。复旦的蒸馏原水肯定可以养鱼，因为一周就会出现蓝藻。涉及到酶反应的水，最好用去离子水。 最糟糕的仪器 - 分光光度仪 (核酸分析仪)。太精密，也太

耐药质粒 DNA转化实验 　　本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆，即转化子。 　　 　　【原理】 　　受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca++ 处理，可改变细胞膜的通透性，利于受体菌对DNA的摄取，这种经Ca++ 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）基因，如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内，则可使该细菌获得Apr和Tcr，表现出对Ap和Tc的抗药性。 　　（一）感受态菌的制备 　　【材料】 　　1．菌株 E.coli RRI 　　2．LB 液体培养基 　　3．75mM Cacl2 　　4．其它：灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机 　　【方法】 　　1．将细菌接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养16~20h。 　　2．取新鲜菌液，按1/100的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养2~3h。 　　3．取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,离心5min，弃上清。 　　4．菌体沉淀加入750μl预冷的（4

一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 二、 选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。 三、 酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即

一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶

所周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大难题，一下是本人在试验过程中收集的海藻DNA制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。 一、可大量培养的海洋细菌 1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。 2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和10%的SDS 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。 3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的EP管中。 4、加入等量的氯仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。 5、取上层水相加入0.1倍的3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀DNA。 6、12000r/m离心20分钟，沉淀DNA弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。 本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌（蓝藻）可行。 二、从海水中制备细菌/

一、实验目的与原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。 二、材料以方法 1、 材料：培养菌体 2、 仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、 试剂： 细胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇 无水乙醇，70％乙醇，异丙醇 3 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液 三、操作步骤 （1） 培养菌体 （2） 加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30 min，然后加入等体积的氯仿，轻摇 （3） 12000－15000rpm离

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。 （一） 器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。 （二） 试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20�SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2�SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M

一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具

Southern Blot Flow 一 基因组酶切和电泳 在200 μl 微量离心管中加入： 25 μl DNA样品(约10μg)， 3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl） 5 μl 相应的10×buffer， 补水到50μl。 然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25―30V稳压电泳12―16hrs。 注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。 二 转膜 1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。 注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不

一、概述 　　前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 　　核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。典

四、核酸探针的标记和检测 　　分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近些年来，人们在寻找非航船性标记物方面取得了很大进展，国际上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒，在国内也已具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前，非放射性标记物有下述几类：金属如Hg，荧光物质如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）。半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（A

五、核酸分子杂交的类型 　　随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 　　由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。 　　液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。 　　（一）固相膜核酸分子杂交方法 　　固相核酸杂交多

六、核酸分子杂交实验因素的优化 　　（一）探针的选择 　　根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。 　　在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类

一、实验材料 1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是3~undefined105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。