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搞定 CRISPR/Cas9 系统操作

CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具,今天我们介绍 CRISPR/Cas9 系统操作。以下操作说明是基于作者冰糖个人实验室操作,仅供参考。质粒介绍我们使用的是 Feng Zhang 实验室的系统的 pX330 质粒,如下图所示:酶切系统37 ℃, 3 hr;Run 1% gel,回收。Elute 到 50 mL H2O。我们利用 BbsI 消化载体形成粘末端,以利于下游 oligo 退火产物的连接;酶切时请充分,且绝对不能加 CIP 处理。Target 设计Target 设计:通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到 NGG(N 代表任意核苷酸),然后找到其紧邻的上游 20 nt 即可(如上图)。 目的位置的选择:我们绝大部分时候的目的是完全 KO 一个基因,其原理是利用移码突变(CRISPR/Cas 系统诱导产生 indel)。所以我们一般选择距离起始密码子 ATG 下游 200bp 范围内的 exon 区域。另外,通常一个基因往往会转录成 2 个以上的 isoforms,所以请选择尽量靠近 5』端的公共部分,保证每个 isoform 都会成功移码突变 通常情况下,

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1 秒搞定学术论文中的三线表

在进行文章的撰写时,总是少不了一些表格的绘制,当然最标准的表格就是三线表了。首先,介绍一下三线表,所谓三线表呢,当然就是只有三个线的表格,知道听到这里,估计想有打我的冲动。一个标准的三线表就长这样:三线表,通常包括表头、表身与表注等,第二条线最细(通常为 0.75 磅)。用来作为区分的界限,上下的线较粗(通常为 1.5 磅)。那么如何绘制一个三线表呢?常规版的三线表格的绘制方式,如下:第一步:绘制一个表格;【插入】----【表格】;直接用鼠标绘制出三列的表格即可;第二步:选中表格,选择【表格工具】中的【设计】;第三步:选择边框线的粗细 1.5 磅,然后选中边框刷,在第一条线与最后一条线上进行绘制;再次选择 0.75 磅,选中表格中的第二条线进行绘制;绘制好的表格如下;当然你会发现与常规的三线表格不同,怎么多了很多莫名其妙的线框呢?第四步:清除不必要的线框;首先选中刚刚修改好的表格,然后点击边框;选中整个表格后,点击上边框与下边框;然后在选中表格的第一行,选中上边框与下边框即可,这样多余的边框线就全部都隐藏起来啦~完美绘制的三线表格如下图:你以为这么简单就好啦?too young~高手分

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临床博士大把时间花在实验室,正常么?

我是临床的,最近投了一篇在 cellbiology international, 投这种纯基础研究的杂志总觉得不踏实,毕竟做实验这块儿比起专门的这方面的人才来说还是很大差距,所以心中忐忑不安。再加上以前被拒过一次,自信心受到很大打击,上次评审的回复很严厉,感觉我的文章就是垃圾,毫无可取之处。毕业日益临近,找工作也在即,临床还没上(一直在忙着做实验,写文章,投稿),心急如焚啊。每天把邮箱要打开无数次…(开机和关机前固定要打开一次)这书读的,我一临床的博士,搞了一年半的实验和文章,临床都不敢上,就怕文章出不来,毕不了业……(来自丁香园站友@时间的掌柜)@auxin:发现一个问题,一般对基础研究深恶痛绝的博士,往往来自于一个基础研究不扎实的实验室。这样对于相当一部分人来说,与其说基础研究本身不重要,倒不如说一个基础薄弱的实验室把原本踌躇满志的博士们折磨得认为基础研究不重要。其实 SCI 本身是很重要的。前一阵子看到有个人写的一段话,把 SCI 比作 「货币」。只要有文章,再经过合理操作,那么什么都能兑换到。因为只要有文章,那么将来就可以换经费、文凭、奖金、知名度、人脉、参加会议、职位、职称、

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学术造假屡禁不止,PubMed 却关闭同行评议

打开 PubMed Commons 官网,可以看到「PubMed Commons to be discontinued」字样,即将停止运营的意思。这不免让人联想到前段时间 PubMed 停更事件,经费不足或许是 PubMed commons 网站关闭的导火索,主要原因可能在于:① 用户的长期参与度不高;② 对于论文发表后的同行评议,可替代网站平台的增加。点「Read more」进一步查看告示:本月 15 号之前,PubMed Commons 仍接受新的评论;截止到今年 3 月 2 号,仍可通过 PubMed 和 PubMed Commons 查看过往评论;3 月 2 号后,就需要到 NCBI 官网查看了。01 PubMed Commons 起源2013 年 10 月,美国国立生物技术信息中心(NCBI)为鼓励学者对已发表论文进行公开讨论,强化论文发表后的同行再评价,推出 PubMed Commons 网站,作为一个允许学者在 PubMed 收录的任何摘要下方添加评论的在线论坛。牵头的 PubMed 作为文献检索的集大成者,广受好评,收录的生物医药类期刊巨多巨广,占据天时地利人和,有利于

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奇葩规定,非博士生不能署名!| 谈谈论文署名之祸

今年 9 月份,美国罗格斯大学解雇一名华人科学家的事件闹得沸沸扬扬。被解雇者声称其因为要求合理的论文署名(由第二作者改为共同第一作者)而被老板解雇。校方在公开的解雇信中给出的主要解雇理由则是动物护理不当。被解雇的华人科学家 Xiaoqi Xie△ 图片来源:sciencemag涉事双方千差万别的说辞让事情的真相变得扑朔迷离。但无论如何,这件事多多少少由论文署名而起。而论文署名的问题则是学术界永恒的话题。论文署名事关研究成果的归属,却很难做到让各方满意。奇葩规定,非博士生不能署名!2016 年 6 月 15 日,复旦大学的副教授郑磊可能做梦都没有想到会因为一篇朋友圈在网络上窜红。他的一篇吐槽某核心期刊「非博士生不能署名」的规定在朋友圈炸了锅。郑磊透露期刊主编要求其删掉一篇准备刊发的论文上硕士生的署名,原因是期刊规定硕士生不能联合署名。为了给自己的学生争取署名权,郑磊选择从期刊撤稿。△ 图片来源:全景网该期刊向郑磊解释称,他们之所有「非博士生不能署名」这个规定,是因为之前有太多人情稿。之前他们多次向某些知名教授约稿,教授没空写就让学生写,质量堪忧。期刊希望以这个规定一定程度地抵挡人情稿。该

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福建泉港 6.97 吨碳九泄露,这些知识你必须懂

据中新网、凤凰网等报道,11 月 4 日凌晨,福建泉港东港石油化工公司在装卸作业时造成 6.97 吨裂解碳九泄露,导致 6.97 吨碳九产品泄露,对水体、大气造成污染。△ 图片来源:中新网碳九是啥?「碳九」是石化工业中的一类常见产品,即产品分子中含有 9 个左右的碳氢化合物。由于分子量及物化性质接近,工业上进一步细分成本较高。因此「碳九」这种多组分混合物常常作为产品直接运输使用。碳九分子量是一种介于汽油和柴油之间的石化产品,应用不及汽油和柴油普及,是石油化工的一种常见副产物。但碳九通常来自于石油化工中的两个环节。原油经过裂解会产生以脂肪烃为主要成分的裂解碳九,这类碳九不含有苯环类物质。另一类碳九如果经过重整环节,则会发生芳构化进而得到含有苯环的多种芳烃类物质,包括异丙苯、正丙苯、乙基甲苯、茚、均三甲苯、偏三甲苯、连三甲苯等。典型芳烃碳九物质结构式及球棍模型这两种碳九的主要区别就在于是否含有芳烃物质,而这也是导致这两类碳九毒性差别的关键组分所在。碳九危害就直接毒性来讲,含有芳烃的重整碳九由于其本身的生理毒性,具有比较大的危害。对着纯纯的芳烃碳九猛吸猛泡,过上半天一天人都会中毒而死,即便一

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大牛又凭单细胞研究发了 nature?其实套路我们也能学

每个人都有一个「私人」的适应性免疫组库,包括 B 细胞受体、T 细胞受体,它们通过基因重组和体细胞超突变获得多样性,从而使免疫系统识别和抵御各种内部和外部的敌人,实施有针对的防御。研究 B 细胞或 T 细胞的多样性,是现今一大科研热点。Structure and function of antigen receptors. (Ann Clin Transl Neurol. 2016 Feb 25;3(4):295-306.)人的免疫系统本身就是一个非常复杂的体系,免疫系统在自身免疫疾病、传染病、癌症等多种疾病中扮演者至关重要的角色。针对免疫组库的研究,在药物和疫苗研发、疾病诊断(如:biomarker)、微小残留病检测、器官移植后监测等都具有重要意义。在人类免疫组库研究过程中,高通量测序的出现,较为全面且真实的揭示了 T 细胞 /B细胞受体免疫组库的多样性和复杂性,是免疫组库研究中一个重要的技术手段。免疫组库测序即以 T/B 淋巴细胞为研究目标,对其产生的多样化免疫分子例如膜型免疫分子BCR 和 TCR、分泌型免疫分子抗体等进行测序研究。Single-Cell RNA-Sequenci

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2018 全球科研城市 200 强公布,北京位列榜首

2018 年自然指数科研城市前 200 强排行榜公布,北京依然是位列全球第一的城市。图片来源:natureindex.com自然指数统计了全球 82 个高水平科研期刊所发论文的作者信息。根据自然指数计算,科研城市 50 强中,中国有 10 座入围。北京 NO.1,上海NO.7,南京 NO.12,武汉 NO.19,广州 NO.25,香港 NO.26,合肥 NO.27,杭州 NO.33,天津 NO.35,长春 NO.42。美国在 50 强中,有 19 个城市位列前 50,中国有 10 个。在生命科学领域排名榜前 20 名中,纽约位居榜首,北京排行第 6,上海排行 15,但是在 20 个企业科研城市中,中国没有城市上榜。图片来源:natureindex.com稳居榜首的帝都北京北京依然成为自然指数科研城市的领头羊,得益于其一流的大学,包括清华,北大,北师大等以及一流的科研机构,中国科学院大学,中国科学院化学研究所等一流的科学研究所。做为国家的政治和文化中心,北京具备的科研人数和科研经费是其他城市无法比拟的,而其科研力量更多的在于基础研究。图片来源:natureindex.com按照 2018

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初学者必备的 WB 实验操作图解

看整段的文字很烦?我们给大家准备了图解版~

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我能做出供发表的 IHC 图像,是总结了前 99 次的经验

基础科研离不开免疫组化(IHC)的实验方法,因为要实现组织中蛋白的可视化定位和定量,并有助于发表高影响因子的文章。临床病理学离不开免疫组化技术,因为它能用于定义正常细胞和疾病过程,并有助于发现疾病治疗的潜在方法。无论您是 IHC 实验的新手还是久经战场在病理科奋战的老将,一定对下面的免疫组化五步非常了解甚至游刃有余了,但是想要获得高质量 IHC 图像,不免有点「道理都是懂的,就是做不到」的捉急。为什么获得高质量的 IHC 图像不是件容易的事呢?因为有太多的要点值得注意。01 样本处理02 抗原修复03 背景封闭04 检测靶点05 样品观察

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测 A260/A280 、A260/A230 就知道 DNA 纯不纯,这是为什么呢?

事情的起因是酱紫的,上周日分子生物学公开课上,DANNY 提了这样一个问题。大家还记得不,用紫外吸收法测定核酸浓度与纯度,这个一个非常经典实用的实验,可能会做,不一定知道原理吧?今天我们就来详细的扯一扯。1.A269、A280、A230 到底是怎么来的? 蛋白质是由氨基酸组成的对不对?这些氨基酸在可见光区都没有光吸收对不对?具体可以去翻看生物教材。但是在紫外光区色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是有吸收的。他们的最大吸收波长分别是 279、278、259 nm。当用紫外光度法测定这些氨基酸的含量的时候,蛋白质在 280 nm 处的紫外光吸收达到了最大值,绝大部分是色氨酸和酪氨酸引起的。 核酸(包括 DNA 和 RNA)的嘌呤和嘧啶具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸、和核酸在 240~290 nm 的紫外波段有一个强烈的吸收峰,最大吸收值在 260 nm 左右,而蛋白质在这一区域有很弱的吸收。 230 nm处是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。 2. 纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.83.A260/A280 、A260/A230 有何意义? A260/A280 、A2

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年轻人在国内做点像样科研,到底难在哪里?

近几年,屠呦呦教授获得诺贝尔奖、韩春雨老师在 Nature Biotech 发表重大原创成果、杭婧在 Science 上发表生物科学基础原理研究重大突破等等。这一切让我们感受到了国内科研的飞速发展。 中国论文数量世界第一,但是我们不得不承认——引用率排在 100 名以后。这说明我国科研论文的质量总体上依然还很糟糕。对于大多数的科研人员来说,在国内做出一些在国际上拿得出手的高水平科研依然很难。 其实从科研设备等硬件来看来看,我国一流大学并不比国外的大学差,甚至更好。国内的普通大学在硬件上也有很大的改善,但是我们的科研质量还是上不去。 我联系并咨询了国内外的同学、师兄师姐,他们大部分已经结束了博士生涯,陆续回到国内大学,可以说是年轻科研人员的典型代表。通过与他们交流,我发现国内科研还是很难,主要体现在下面 5 个方面。 1. 科研材料难获取 以我当时的课题为例,我需要已敲除部分基因的质粒,我想获得并非易事。国内相关科研人员不太愿意互相交流,也不易得到。国外虽然有商业化质粒,但价格昂贵。后来我不得不自己构建,整整花了一整年,还不太成功。 像质粒、转基因或基因敲

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北大博士教你如何瞬间秒杀英文参考文献?

本期主要介绍如何运用 NoteExpress 来管理参考文献。 本讲要解决的问题 1. 看了师兄师姐的毕业论文,每一章都要列出 100 篇左右的参考文献。 2. 还要用固定的格式来书写参考文献。 3. 有些文献对我比较重要,有些相对不重要。把这些文献放在一个文件夹里,下次看到时难以区分。 4. 已经标上参考文献的毕业论文,后期修改一下,参考文献的序号又乱了...... 本讲内容 1. 参考文献管理软件 2. 新建和备份数据库文件 3. 检索在线文献并导入题录 4. 给题录添加笔记和附件 5. 将题录导入到 Word 论文中 本讲的相关配置 1. 操作系统和配色方案:WIN7 Home Basic 2. 屏幕分辨率:1024×768 3. 办公软件:Microsoft Office 2010 Word 使用 NoteExpress 管理参考文献? NoteExpress 是一款经典的国产汉化界面的软件,广泛应用于高效图书馆。使用过程中需要用到 Word 。 Word 加载项:参考文献管理软件基本上都有 Word 加载项(Word 插件),可以方

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集美貌和才华于一身的美女博士特辑

那个集美貌与才华于一身的 Papi 酱火的一塌糊涂,那么在学术界,也有一些和我们差不多年纪,集美貌与才华于一身的女博士也火了。请随霸霸一起来看看。 1.杭婧:拼命婧姐——追求卓越 杭婧,武汉大学本科毕业,清华大学 2012 级博士生,施一公教授科研团队成员。 她以第一作者(共同)身份在国际顶尖期刊《Science》上发表了 2 篇封面文章,科研成被施一公教授称作超过了他过去 25 年科学成果的总和。 这一研究成果标志着人类对生命过程和本质的理解往前迈进了关键一步,是生物科学基础原理研究领域的重大突破,被誉为近 30 年中国在基础生命科学领域对世界科学做的最大贡献。 霸霸点评:她曾平均每天 12 小时、基本无双休泡在实验室拼命工作,打鸡血般地读文献。但只要她下定决心攻克一个难题,就会没日没夜、废寝忘食地投入到工作中去。仅仅完成任务也不是她的风格,她要追求的是卓越的研究成果。 2.Sara Volz 拿大奖——科学真爱粉 Sara Volz,17 岁时还是美国科罗拉多州科泉市夏

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献给初学者:如何预测基因间的相互作用?

对于生物学领域的研究生来说,很多时候我们研究一个通路,或者想要知道两个基因或者多基因间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用,该从哪下手呢?下面我想详细的介绍一个基因间相互作用的预测网站—GeneMANIA,网址: http://genemania.org。首先看 Help 里对 GeneMANIA 的简介:GeneMANIA searches many large, publicly available biological datasets to find related genes. These include protein-protein,protein-DNA and genetic interactions, pathways, reactions,gene and protein expression data, protein domains and phenotypic screening profiles. Data is regularly updated.可以用来发现相关基因,包括蛋白 - 蛋白,蛋白 - DNA 和遗传相互作用、通路、生理生化反应、基因和蛋白表达

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基因功能研究第一步:轻松敲基因

基因研究中,敲除基因,研究该基因的功能是最常用的套路。一般 ShRNA 可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达, 是基因研究中必不可少的环节。下面就主要围绕设计 ShRNA 引物序列,手把手教你构建 ShRNA 质粒,轻松敲基因。ShRNA 的设计原则1. 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列,中间由一茎环序列分隔的,组成发夹结构,由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5~6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。2. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。3. ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。4. 5~6 个 T 必须放置在 ShRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶 III 终止转录。5. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T。这可能导致 ShRNA 转录的提前终止。下面以 pSUPER 质粒载体设计 ShRNA 为例:1. 选择双酶切位点分别是 BglII-HindIII site。2. pSUPER ShRNA design model:红色部分包含限制性酶切位点,绿色部分为茎环序列。3.

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北大博士教你如何将多张图片绘制为一张

今天我们介绍如何将各种位图制作成一张大杂烩图片。 先看看要制作的大杂烩图片 遵循的原则 图片大小调整操作的优先级:保持原像素数目>保持宽高比, 适度缩小>保持宽高比, 适度放大。 ELSEVIER 对大杂烩图片(COMBINATION ART)的要求:最好是 RGB 颜色模式–分辨率至少 500DPI 以上–所用字体符合杂志要求(ARIAL, COURIER, SYMBOL, TIMES NEWROMAN)。 1. 单栏 500DPI 宽度 1772 像素,原始图片像素最好大于此数值。 2. 单栏 600DPI 宽度 2127 像素,原始图片像素最好大于此数值。 相关视频查看>>

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2 招轻松应对投稿时编辑对抗体特异性的质疑

实验室大师姐是位学霸,这学期结束就要毕业了,她奋起神勇准备发一篇高分的文章,也算是自己学生生涯的完美总结和对自己的交代。经历了九九八十一天的废寝忘食实验后,大师姐信心满满的给某 SCI 影响因子分数颇高的杂志投递了自己的文章,结果却收到了杂志编辑如下的提问回复:无独有偶,以 nature 系列杂志为例,提交论文需要完成 reporting summary 的一系列问题,其中有一个必答问题如下:9. AntibodiesDescribe the antibodies used and how they were validated for use in the system under study (i.e. assay and species)。类似对抗体验证(抗体特异性)的质疑不再仅限于 science,nature 等高分杂志,由于生物试剂普遍存在的特异性问题导致实验结果不可重复1,已经引起主流学术期刊的关注。编辑们正逐渐提高对抗体特异性问题的重视,并要求提供抗体特异性的证据。事实上,抗体的特异性问题,就是我们常说的「脱靶」。市面上抗体的品质良莠不齐,有相当一部分抗体并不能正确识别

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如何将 Excel 数据图转换为高清位图?

文章里这样的图怎么做?这叫大杂烩图,但大杂烩图的绘制并不容易。因为其既有矢量图,又有位图。矢量图放大不会出现锯齿模糊,位图放大之后会出现锯齿模糊。 Photoshop 对矢量图的处理功能有限。所以推荐大家把矢量图转换为高清位图后,用 Photoshop 进行拼合。 本节课和大家说说如何解决难点: 如何将 Excel 数据图(矢量图)转换为有较高像素数目的高清位图? 方法一 适合电脑装有 Illustrator 的同学:Excel 图表→粘贴到 Illustrator→另存为 EPS 图片→用 Photoshop 打开 EPS 图片→另存为高清 tif 图片。 方法二 适合没装 Illustrator 的同学:Excel 图表→粘贴到 PPT 中(链接工作簿)→另存为 EMF 图片→将 EMF 导入到大 PPT 中→拖大图片→另存为 tif 高清图片→Photoshop 添加白色背景 矢量数据图转化为高清位图的推荐方法: 常见误区: 更多请点击手把手指导视频>>

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研究生分 3 大派系,你属于哪一系?

不知道你有没有发现突然间朋友圈出现了一大波佛系养蛙(儿子)的中年少男少女~那么读研究生的你是否属于佛系,或者又属于其他哪一派系的呢?可能你也不是很清楚自己的属性,没关系,做下面的测试题分析一下吧。做测试题之前的准备:一支笔、一张纸。记录自己的答案选项,如果你的计算能力一般的话,准备一个计算器也是十分推荐的;如果你想说你的脑子超越常人,记忆力极好、心算能力极强的话,前面的准备当我没说吧。准备好了吗?下面开始进行测试,一定要按照自己的真实想法进行选择,这样你的科研属性测出来才比较准确哦~1. 在科研中,导师交代你的事情你会什么时候去做?看心情;马上着手去做;deadline 之前;2. 你对自己的科研状态感到满意吗?也没什么追求,开心就好;还有提升的空间;当然啦,活在当下,该安则安;3. 当你的文章被拒后,你是下列哪种状态?一切随缘,再试试下个期刊呗;这么好的文章都能被拒,审稿人瞎吗;求被科研温柔相待,先吃一顿大餐再说;4. 开组会时你的状态?他们都在讲什么?不懂,算了,和我的关系也不大;这个问题分析的不对呀,这人太菜了;这个人好优秀啊,我的偶像,向他学习;5. 发现实验失误,需要重新开始

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