相关专题细胞凋亡细胞凋亡（英语：apoptosis，源自希腊语：απόπτωσις，有堕落，死亡之意），为一种细胞程序性死亡。相对于细胞坏死（necrosis），细胞凋亡是细胞主动实施的。细胞凋亡一般由生理或病理性因素引起。而细胞坏死则主要为缺氧造成，两者可以很容易通过观察区分开来。在细胞凋亡过程中，细胞缩小，DNA被核酸内切酶降解成180bp-200bp片段属于有层次之断裂，（可以通过凝胶电泳证明），而细胞坏死时，细胞肿胀，细胞膜被破坏，通透性改变。细胞器散落到细胞间质，需要巨噬细胞去清除，结果是该局部组织发炎。相比起细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式。 出现细胞凋亡是动物发育过程中的必经之路：正常人；正常组织中要使细胞内之新生与维持平衡（皮肤表皮细胞的更替）已知的例子：从蝌蚪到蛙的变态发育；昆虫的蜕变高等哺乳动物指间蹼的消失；眼睛中玻璃体和晶状体的细胞死亡，是眼睛对光通透重要的一步。自然杀手细胞（NK）对癌细胞的非专一性胞杀作用在人体胚胎发育中，四肢的发育也是一个很好的例子。胚胎长到第5周时出现扁盘状的肢体萌芽，手指和脚趾之间的蹼消失，四肢才能顺利形成其最终形态。就是在成熟

相关专题蛋白表达技术全攻略 本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli 在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。

1、Allele-specific PCR： 等位基因特异性PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变定位在（或接近）引物的3'端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示不同的基因型。 2、Assembly PCR(也称作Polymerase Cycling Assembly或PCA)： 组装PCR通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的DNA链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向DNA链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生最终的长链DNA分子。 3、Asymmetric PCR： 不对称PCR，可选择性的扩增出靶DNA的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称PCR的基础上发展出Linear-After-The-Exp

病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。本试验主要用于：（1）从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；（2）用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；（3）测定抗病毒血清或抗毒素效价；（4）新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。1、血清中和实验鉴定新城疫血清中和实验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体，以确定鸡群是否感染过新城疫。中和实验可以在鸡胚或细胞培养以及易感鸡中进行。方法是：在鸡新城疫免疫血清（或待检血清）中，加入一定量的待检病毒（或已知病毒），两者混合均匀后，接种10～11日龄的SPF鸡胚，或鸡胚成纤维细胞，或有易感性的鸡，并设立不加血清的病毒对照。结果注射血清和病毒混合材料的鸡胚或鸡不死亡，鸡胚成纤维细胞无病变，而对照组死亡或细胞培养出现病变，则肯定为新城疫病毒。2、血清中和实验诊断猪瘟将不同稀释度的血清与已知浓度的

【实验目的】 1．掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理。 2．了解血清丙氨酸氨基转移酶的测定方法及临床意义。 【 实验原理 】 丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化丙氨酸与α—酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸。 丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小。 丙酮酸可与2,4—二硝基苯肼在酸性溶液中反应形成相应的2,4-二硝基苯腙，呈黄色，后者在碱性条件下呈红棕色。通过测定其在520nm波长处的光吸收来了解丙酮酸的生成量，借此测定血清ALT的活力，故该类方法又称比色测定法。该法虽然也有缺点，但操作简便，不需要特殊 仪器 和 试剂 ，故在临床上被广泛应用。

正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养 一、实验试剂1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S4、染色液： 0.4% Trypan Blue5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：抗小鼠CD 11b/c抗体，荧光标记二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、10ml注射器6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓去除大脑脑膜及血管,剔除海马部分↓1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表层血丝↓先用眼科镊将组织撕碎成糜状，用眼科剪反复剪10min，再用移液器轻轻吹打20~30次。↓将组织转移至15ml离心管中，加入消化液（PriCells）↓将离心管放置到37℃，15-20min水浴恒温消化↓加入消化终止液（PriCell

一、目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、材料、主要 仪器 和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要 仪器 （1）分析天平、台式天平

【 目的和原理 】 蛙类的一些基本生命活动规律与温血动物相似，而维持其离体组织正常活动所需的理化条件比较简单，易于建立和控制。因此，在实验中常用蟾蜍或蛙的坐骨神经腓肠肌标本来观察兴奋与兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生命现象和过程。故制备坐骨神经腓肠肌标本（sciatic nerve-gastrocnemius muscle specimen）是机能学实验中必须掌握的一项基本技术。本实验要求掌握制备坐骨神经腓肠肌标本的技能，并获得兴奋性良好的标本。 【 实验材料 】 模式生物与实验动物论坛 蟾蜍或蛙；蛙板、玻璃分针、普通剪刀、手术剪、镊子、探针、玻璃分针、蛙钉、瓷盘、滴管、培养皿、锌铜弓；任氏液（Ringer’s solution）。 【 实验步骤 】 标本制作方法： 1.破坏脑和脊髓 取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握住蟾蜍，用食指按压其头部前端，拇指按压背部，右手持探针于枕骨大孔处垂直刺入，然后向前通过枕骨大孔刺入颅腔，左右搅动充分捣毁脑组织。然后将探针抽回至进针处，再向后刺入脊

相关专题检测基因表达水平用于检测基因表达水平的 DNA 微阵列实验，应用之一是比较实验，目的是比较两个条件下的基因表达差异，从中识别出与条件相关的特异性基因，例如，识别可用于肿瘤分型的特异基因等。为了提高实验的可靠性，对于同一样本，往往有两次或更多次的重复实验，但是，由于 DNA 微阵列的费用仍然很昂贵，不可能重复足够多的次数来满足实验数据分析的要求，因此需要采用统计方法来分析这些数据。对于这些表达数据的分析，目的就是要识别在两个条件下有显著表达差异的基因。何谓显著表达差异？通常是指一个基因在两个条件中表达水平的检测值在排除实验、检测等因素外，达到一定的差异，具有统计学意义，同时也具有生物学意义。常用的分析方法有三类，第一类称之为倍数分析，计算每一个基因在两个条件下的 Ratio 值，若大于给定阈值，则为表达差异显著的基因；第二类方法采用统计分析中的 t 检验和方差分析，计算表达差异的置信度，来分析差异是否具有统计显著性；第三类是建模的方法，通过确定两个条件下的模型参数是否相同来判断表达差异的显著性，例如贝叶斯方法。 8.3.1 倍数分析 早期基于 cDNA 微阵列技术的比较

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。3. 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合。4. 混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复

相关专题western blot实验 western blot实验常用于检测蛋白表达量、蛋白表达产物的正确性等。相对于其他检测蛋白的方法而言Western Blot实验在蛋白的定性定量分析、与目的蛋白量的比较方面更简单一些。 虽然，顺利的时候western blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。 良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略

细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培

长期困惑原料药企业:开发 D？研究 R？ 在申报制剂时，有时欧美国家需要原料药的研发信息 因DMF及COS申请没有强制要求提供，所以研发部分的国际化程度很弱 SFDA的注册资料的要求往往经常参考 现在美国已经要求在DMF中的研发部分要参考ICH的Q11 关键质量参数是发达国家常用的也是Q11的所围绕的核心内容 国内-原料药生产工艺的研究原料药生产工艺的研究 1)详述采用路线的理由，说明与文献报道路线的区别与改进情况 2)表述被比较的反应路线及化学反应式，包括反应条件和收率 3)表述采用的反应路线、化学反应式(注明反应条件和收率)及工艺流程图 ·表述详细的操作步骤 ·注明投料量(包括摩尔数)、收率、可能杂质或其他中间休、主要理化常数 ·各步反应的终点控制方法 ·主要中间体和成品的精制及质量控制方法并提供相应的数据图谱 4)化学原料的来源、规格及标准 5)抗生素的菌种选育、发酵培养条件、提取工艺及收率 6)至少3批样品的中试工艺及数据(包括设备、生产控制参数、投料量、中间体及成品数量及得率) 7)三废处理草案或详细的三废处理方案 8)参考文献 IC

一、按实际用途分类 实验用动物分为：实验动物、家畜家禽观赏动物、野生动物 二、遗传学分类 1. 同基因型动物 （1）近交系动物是同胞兄妹或亲子之间交配20代以上，基因纯度可达98.6%以上。 血缘系数（R）：个体间遗传相似的程度达99.6% 近交系数（T）：个体间遗传基因纯合的程度达98.6%（2）杂交子一代动物两个不同的近交品系动物之间进行有计划交配所获得第一代动物，简称F1动物。F1动物不能培育出纯系动物，因在F2代时会发生遗传上的性状分离和基因重组。使用F1动物的优点： ①杂交优势，生命力强，对环境适应性和对实验的耐受性强，抗病力强，繁殖旺盛。 ②具有与纯系动物相似的遗传均质性。 ③对各种实验结果重复性好 ④具有亲代双亲品系的优点 ⑤国际分布广。对F1动物的要求： ①两个亲本必须都是近交品系动物 ②杂交子一代只能作实验用，不能作种群用。 ③在命名书写中，雌性品系在前，雄性品系在后。（3）突变系指近交系动物培育中，正常染色体基因发生突变而形成了各种遗传缺陷的品系。 突变系动物的特点及应用 ①遗传变异在自然界广泛存在，具有不定向性，帮助人们认识生

相关专题磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。然而，有时会遇到一些问题，例如，磷酸化抗体检测不到总蛋白，不知道如何使用lysis buffer，Western blot高背景等。本文总结了论坛上的高手整理的实验操作需注意事项，供各位迷途羔羊参考。1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。附：lysis buffer配方&NBSp;Buffer&NBSp;&NBSp;Company Cat.No.&NBSp;StockWorking 100mlMWg/100mlmlTris1.080382.2500(Merck)121.141M12.1145NaCl31434(Riedel-deHaen)58.445M29.223NP-40I-3021(Sigma)10%1010Sodium deoxycholateD6750(Sigma)414.610%102.5EGTA.4NaE8145(Sigma)468.30.25M11.70750.4

【摘要】 目的 对透射免疫比浊法定量测定血清D —二聚体的方法进行临床实验评价。方法 实验评价包括精密度、线性测定、回收实验以及干扰实验。结果 该D-二聚体定量测定试剂在精密度测定CV%小于5%，回收率在95~99%。线性测定良好，可达16ug/ml，回归方程为Y=1.0133X-0.0076，相关系数r=0.9997。对胆红素、血红蛋白、甘油三酯均具有很好的抗干扰能力。结论 该试剂符合临床使用的要求。 【关键词】 D-二聚体定量测定，精密度，线性，干扰 近几年来，应用D-二聚体作为有症状的深层静脉血栓（VTE）的诊断指标已得到广泛的研究。[1]许多研究表明D-二聚体测定对于深层静脉血栓（VTE）、微细血管血栓（DVT）和肺梗死（PE）病症有高度的敏感性。而采用D-二聚体定量测定可以作为排除深层静脉血栓（VTE）、微细血管血栓（DVT）和肺梗死（PE）的第一步筛选。[2] 1 材料与方法 1.1 试剂： 1.1.1 D —二聚体透射免疫比浊法定量测定试剂，滴宝牌，批号021022。

1、新建文件菜单File → New，Assay选择Absolute Quantification（实时定量模式），打开一个空白的96孔板文件。2、探针设置双击任意一个孔，打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。3、首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File → New，新建探针：设定探针的名称（建议使用所研究基因符号加标记荧光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等）、报告基团（FAM或者VIC）、淬灭基团（TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None）、颜色（任意指定）等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。重复此过程，设立其他的探针。4、在Detector Manager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击Add to Plate Docume

摘要： 福尔马林固定石蜡包埋的方法处理（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）的样品代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料，如何从这些样品中挖掘出有效的信息呢？上海伯豪生物技术有限公司针对FFPE样品的高通量分析，建立了整套的SOP 标准解决方案，帮助广大科研工作者更好的利用FFPE 样本资源，进行各类高通量组学分析。以下为公司利用微阵列芯片研究FFPE样品的部分实验案例和解决。 使用芯片技术研究通常需要使用新鲜的样本或快速冷冻的样本，但是世界上大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中，其中绝大多数是FFPE样品。如何获得FFPE 样本所蕴藏的生物信息，如何利用分子生物学方法对FFPE 样本进行检测，进而针对FFPE 样本进行高通量组学分析就变得越来越重要。一、FFPE样本准备、储存及运输 样本质量是确保下游研究应用(微阵列芯片、新一代测序，Real-Time PCR等)中获得高质量数据的关键。 FFPE 样本质量与样本固定时间，储存条件与储存年限等密切相关。 二、FFPE样本的质量控制 采用N

外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法 — 脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。【试剂与仪器】 1 、胎牛血清。2 、双抗溶液（链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位）。3 、DMEM 培养基。4 、转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。5 、细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。6 、PBS 。7、无血清培养基。8 ．胰酶（ Trypsin ）。9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。

各种转染方法比较细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法, 磷酸钙法,阳离子脂质体法,阳离子聚合物,病毒介导法,Biolistic 颗粒传递法 （基因枪粒子轰击法）, 显微注射法,电穿孔法等,对各种方法的原理,应用,特点,厂家产品等信息的比较结果如下表: 转染方法 原理 主要应用 特点 厂家及产品 DEAE－葡聚糖法 带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时转染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) 磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染,染瞬转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多 GIBCO BRL ，Promega 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进