纸色谱属于液-液分配色谱。 纸色谱使用的滤纸是载体，附着在纸上的水是固定相。样品溶液点在纸上，作为展开剂的有机溶剂自下而上移动，样品混合物中各组分在水-有机溶剂两相发生溶解分配，并随有机溶剂的移动而展开，达到分离的目的。 选择纸色谱条件主要是选择合适的展开剂。 合适的展开剂一般有一定的极性，但难溶于水。在有机溶剂和水两相间，不同的有机物会有不同的分配性质。水溶性大或能形成氢键的化合物，在水相中分配得多，在有机相中分配少；极性弱的化合物在有机相中分配多。展开剂借毛细管的作用沿滤纸上行时，带着样品中的各组分以不同的速度向上移动。水溶性大或能形成氢键的化合物移动得较慢，极性弱的化合物移动得较快。随展开剂的不断上移，混合物中各组分在两相之间反复进行分配，从而把各组分分开。 纸色谱在糖类化合物、氨基酸和蛋白质、天然色素等有一定亲水性的化合物的分离中有广泛的应用。 纸色谱的操作与薄层色谱很相似，只是纸色谱的载样量比薄层色谱更小些。

1、组织块培养法 （1）按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm 3 大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。 （2）将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶（底面积为17.5cm 2 ）可接种20~30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 （3）培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 2、消化培养法 该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散

相关专题 固相萃取(SPE)—用途广泛的样品前处理技术 一 固相萃取 固相萃取 (Solid Phase Extraction，SPE)是一种基于液-固分离萃取的试样预处理技术，由柱液相色谱技术发展而来。SPE技术自70年代后期问世以来，由于其高效、可靠及耗用溶剂量少等优点，在环境等许多领域得到了快速发展。在国外已逐渐取代传统的液-液萃取而成为样品预处理的可靠而有效的方法。 SPE技术基于液相色谱的原理，可近似看作一个简单的色谱过程。吸附剂作为固定相，而流动相是萃取过程中的水样。当流动相与固定相接触时，其中的某些痕量物质(目标物)就保留在固定相中。这时用少量的选择性溶剂洗脱，即可得到富集和纯化的目标物。固相萃取 可分为在线萃取线萃取前者萃取与色谱分析同步完成;而后者萃取与色谱分析分步完成，两者在原理上是一致的。 一般固相萃取 的操作步骤包括固相萃取柱(即吸附剂)的选择、柱子预处理、上样、淋洗、洗脱。在实验过程中需要具体考虑的因素如下： 1)吸附剂的选择 a.传统吸附剂 在环境分析中最为常用

问题：最近要做CHIP，有一点疑惑：如果超声过程正好把目的基因断开，PCR时应该就检测不到目的基因了啊！有这样的情况吗？解答：1. 超声要摸条件，使DNA 片段大都控制在300-500bp（其实200-800bp也可以的），太小了基本都打断了，没法PCR。2. 设计PCR引物时，产物的长度不要太长100多就可以，产物太长不容易P出来（原因可能就像你想的那样，DNA被打断了）3. 不同的细胞，不同的固定条件，特别是不同的仪器都不一样的，只能慢慢摸条件，我做ChIP实验，在超声这个地方浪费的时间最多了你说你的条带是100左右，你可以试试：（1）降低振幅和超声次数（减低的幅度大点）（2）你确定100bp不是RNA（你电泳前去RNA了吗？），在上样孔前面有没有条带呀（除了超声过了之外，还有可能超声不足，我当时就这样）问题：最近摸超声条件摸了好一阵子了，感觉条带片段差不多了，怎么做input却扩不出目的基因呢？我的目的基因是318kb，但同时我用其它引物，产物长度分 别为500和800的都能扩出来，唯独想做的目的基因扩不出来，怎么回事呢？用未超声的细胞，目的基因的引物是没有问题的，超声后怎么做不

1. 溶液准备：包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）， 20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物2. 实验程序：1 ） 将捕获抗体包被液稀释至相应的浓度。2 ） 在对应的孔中加入100μl抗体溶解液，室温孵育2h或4℃过夜。3 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。4 ） 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h.5 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗脱液清洗两次。6 ） 每个孔中加100μl生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h或室温孵育3h.7 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。8 ） 每个孔中加100μl AKP偶联的链球菌亲和素，室温孵育1h.9 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗脱液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。1

问：在elisa实验中，抗体要不断冻融，特容易失活，不知道有什么配方可以使抗体和酶在4度中长时间保存? 答1：抗体溶液忌讳反复冻融。当你获得一个较大包装的抗体后，一般要先将其分装，每次取一小支使用，可于4度短期保存。 答2： （1） 分装的时候每管容量不宜过少，管数不宜过多，因为管壁也会吸附部分抗体溶液。 （2） 不要用玻璃容器分装，因为会导致蛋白失活 （3） 千万不要预先稀释，稀释后抗体效价降低很多 答4：高浓度的抗体存放于4度尚可，但是如果浓度过低就不好了，容易使效价降低。建议还是分装保存。 答5： （1）腹水：腹水重组后可加入少量叠氮纳等来阻止细菌生长。腹水应当冻存。单抗最好能够小包装保存以避免反复冻融。若要保存较长时间，则不要在4℃。和血清不同，腹水中含有蛋白酶，会使抗体效价下降，因此加入蛋白酶抑制剂可以选择。 （2）纯IgG:不要稀释抗体后来保存，除非加入羊血清，BSA等后。IgG会和玻璃，塑料等粘附。当IgG的浓度小于0.1 mg/ml 会很快被吸收并变性，而失去活性。且反复冻融纯IgG肯定会使其活性降低。 （3）血清：血清比

压力蒸汽灭菌器的种类 根据冷空气排放方式的不同，压力蒸汽灭菌器分为下排气式压力蒸汽灭菌器和预真空压力蒸汽灭菌器二大类。下排气式压力蒸汽灭菌器也称重力置换式压力蒸汽灭菌器，其灭菌是利用重力置换的原理，使热蒸汽在灭菌器中从上而下，将冷空气由下排气孔排出，排出的冷空气由饱和蒸汽取代，利用蒸汽释放的潜热使物品达到灭菌。预真空压力蒸汽灭菌器的灭菌原理是利用机械抽真空的方法，使灭菌柜室内形成负压，蒸汽得以迅速穿透到物品内部进行灭菌。根据抽真空次数的多寡，分为预真空和脉动真空二种，后者因多次抽真空，空气排除更彻底，效果更可靠。 压力蒸汽灭菌器可以使用外来的管道蒸汽，也可以使用与压力蒸汽灭菌器配套的电蒸汽锅炉随时生产蒸汽。一些小型的下排气式压力蒸汽灭菌器还可以通过电炉、煤气炉加热灭菌锅内的水并使之产生蒸汽达到灭菌目的。一般来说，外来管道蒸汽的汽源较充足，适于较大型的压力蒸汽灭菌器，电蒸汽锅炉单位时间产生的蒸汽量通常较小，需要较长的加热时间。 传统的压力蒸汽灭菌器为单门，随着人们对无菌操作的要求越来越严，双侧开门的压力蒸汽灭菌器越来越多，这类灭菌器特别适用于有清洁区、污染区之分的场所

铁蛋白广泛分布于人体组织细胞内和体液中。是一种贮铁蛋白质。1972年Addison等人建立血清铁蛋白放射免疫测定方法后，相继对外周血细胞及体液中铁蛋白也能测定。现已作为一种重要的铁参数用于临床诊断及人群筛检，现将其近展叙述如下。 一、铁蛋白的分子结构和功能 铁蛋白分子量为450000，由24个多肽亚单位组成一个中间空心的球形蛋白质。其外壳即为去铁铁蛋白。中空核心部分是贮存铁胶体分子团（羟基磷酸化高铁）的地，核心中铁原子含量不等。平均2000个，最多可达4500个。去铁铁蛋白可摄取Fe++，经其6个通道进入核心，氧化成Fe+++沉积下来，铁原子释放时要经还原剂的作用。铁本身又可刺激去铁铁蛋白的合成。 铁蛋白存在于体内各组织和细胞，特别在肝、脾、骨髓中含量高，脑组织中也含有，外周血细胞包括红细胞、白细胞和血小板都含有铁蛋白。不同组织来源的铁蛋白有明显的异质性。人体的铁蛋白达20种以上。总称为异铁蛋白（isoferritin）.它由两种不同的亚单位（L和H）.按不同比例构成，L和H亚单位的分子量和所带电荷量不同，前者分子量为19000.后者为21000，心型铁蛋白为酸性铁蛋白，主

细胞生物学研究中的一些常规操作只是整个项目中微不足道但又非常重要的一步。这些常规操作简单没有技术内涵，却消耗了研究者大量时间与体力，且结果也不能得到保证。其中使用血球计数板在显微镜下进行手动细胞计数首当其冲。 手工计数不仅浪费了研究者大部分的时间，繁冗无聊的计数过程往往让人头晕眼花，影响了研究者的积极性，有种大材小用的感觉。不少研究者提起细胞计数都频频摇头，不仅费时费力，枯燥无味，又没有成就感。同时，手工计数的主观性强，造成计数结果的可靠性大大打折，重复性差。不同操作者之间的计数结果一致性差，无可比性，导致实验结果往往不能重现。 现在社会是个快速发展的社会，自动化代替手工的社会，速度和效率是社会关注的重点。全自动细胞计数分析仪也是顺应时代的要求，应广大研究者和科学领域的需求上市的。全自动细胞计数分析仪摆脱了手工计数细胞的苦差和烦恼。同时结果更加准确客观，操作快速简便，重复性好，尤其为我们节省了宝贵的时间，使研究者把更多的精力放在更重要的工作上。 目前，市面上也出现了多种品牌自动细胞计数仪，有基于细胞图像的，也有基于coulter原理的，但是主要目的就是将人工从繁冗无聊的手工计数中解放出

动物手术前的麻醉不仅是为了减少动物疼痛满足动物福利的要求，也是为了保证动物手术顺利进行。目前注射麻醉在我国的动物麻醉中最为普遍，其优点是不需要昂贵的设备，只需要注射器就行，但麻醉剂注射动物后，必须经肝脏代谢完后，动物才苏醒；剂量过大会造成动物麻醉过度死亡，剂量过小动物不能进入麻醉状态或进入麻醉状态比较慢。在发达国家，气体吸入式的麻醉非常普遍，与传统的药物注射麻醉方式相比，具有以下显著的共同优点： 动物进入麻醉状态较快，苏醒也迅速，一旦停止麻醉，一般2分钟内动物即可苏醒麻醉深度容易控制，若在手术过程中发现动物状态不佳，可马上停止麻醉或者快速充氧进行抢救，因此安全性非常好；动物的发病率和死亡率低，动物手术的成功率高；更重要的是，吸入式麻醉剂在体内不参与代谢，几乎完全由肺泡经呼吸排出，对实验结果不造成影响，研究成果易得到国际认可。在具体的实际应用中，我们可以明显地看到异氟烷吸入式麻醉方式的优势，下面就一些典型的动物实验采用异氟烷麻醉方式的优势，说明如下：1. 套管慢性给药、微透析和光学刺激/生理信号记录（光遗传学）导管植入颅内，待动物恢复后，首先拔出导管帽，然后植入注射内管（探针或光纤）、

一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g﹣1·h﹣1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。二、仪器与用具离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等用具同活体法。三、试剂1. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液；0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液；1%（W/V）对–氨基苯磺酸溶液；0.2%（W/V）α-萘胺溶液（上述溶液配法同活体法）。2. NADH2溶液：称取2.0mg NADH2溶于1ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中（冰箱贮存可用一星期）；3. 提取缓冲液（25mmol/L的磷酸缓冲液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na2混合液）：取250ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，加半胱氨酸0.61g

一、实验目的 　　1.了解细胞膜的渗透性 　　2.了解各种物质进入红细胞的速度 二、小分子跨膜运输概述 　　生物膜对小分子的跨膜渗透包括水、电解质和非电解质溶质。根据人工不含蛋白质的磷脂双分子层研究物质通透性质表明，只要时间足够长，任何分子都能顺浓度梯度扩散通过脂双层。人工合成的脂质体主要用来研究细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。但不同分子通过脂双层扩散的速率差别很大，主要取决于它们在脂类和水之间的分配系数及其分子的大小。分子越小，分配系数越大，通过质膜的速率越快。从图9-1中可以看出，小的、亲脂性的、非极性分子（如O 2 、CO 2 、 N 2 、苯）容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子（如水、脲、甘油等）如果足够小时，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子（如葡萄糖，蔗糖等）可以跨膜扩散运输，但比较困难；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的

一、抗体的定义和第一代单克隆抗体（经杂交瘤细胞生产）抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。70000之间，称为“重链”（H链）。轻、重链之间和两重链之间由二硫桥连接，这样的四链结构（L2H2）组成一个免疫球蛋白分子。；550个氨基酸残基，相对分子质量在55000，61566；抗体的基本结构所示，由四条肽链组成，其中两条相对分子质量较低的肽链约含210个氨基酸残基，相对分子质量约24000，称为“轻链”（L链）；另两条相对分子量较高的肽链约含450，其相应的抗体分别命名为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。61540；、61541；、61537；、61549；、61543；以重链抗原性差异来进行抗体的血清学分类：用分离纯化的各种重链免疫动物获得相应的抗血清，再通过免疫交叉反应等血清学检测方法，分析其结构的异同，反复的验证，最后发现人类有5类不同的重链，与多种细胞结合，可能造成免疫损伤。615

为了证明Bioteke公司SYBR GREEN I实时荧光定量产品的质量，我们用国际知名品牌TaKaRa的SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)实时荧光定量进行对比，在相同的模板、引物和反应体系下，用Bio-Rad荧光定量PCR仪进行了对比实验。 实验材料 小鼠肝脏组织 山东大学实验室提供样品cDNA 实验方法 RNA提取：Bioteke RNApure高纯总RNA提取试剂盒a，操作步骤请参考说明书。 目的基因：小鼠管家基因β–actin，山东大学提供样品基因。 cDNA制备：测定小鼠肝脏总RNA浓度后，使用BioTeke Super RT Kit 制备20μl cDNA。操作步骤参照试剂盒说明书。 一步法荧光定量PCR： Bioteke One-step SYBR real-time RT-PCR Kit 20μl反应体系包括：10μl 2×One-step SYBR premixture,7.2μl RNA Free Water, 0.4μl Primer F

绿色植物的光合作用是在叶绿体中进行的，了解叶绿体色素的组成和性质对于理解光合作用的本质很有帮助。叶片中叶绿素含量与光合强度以及氮素营养又有密切关系。因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用。 原理 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水的混合液提取。叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。 器材与试剂 器材：扭力天平、量筒、烧杯、具塞试管、研钵、离心机、漏斗、滤纸等。 试剂：酒精、丙酮、碳酸钙。 方法与步骤 1. 用于理化性质鉴定和色层分离的叶绿体色素提取： ① 取新鲜植物叶片，如菠菜叶，先在105℃下杀死，再在80℃下烘干(一次烘干量不能太多)，研成粉末，置干燥器中备用，也可用鲜叶直接提取。 ② 称取叶粉2g放入小烧杯中，加入95％酒精20-30毫升，进行浸提。浸提过程中需用玻棒经常搅动，如气温过低亦可适当加热，待酒精呈深绿色时，将溶液过滤到另

问：我最近对肿瘤细胞转染GFP，其中不含有其他外源性基因。转染后短期内发现阳性细胞非常多，可是随着时间及细胞的增殖，培养孔内的细胞总数在不断的增加，但是发绿色荧光的细胞反而较以前少了（培养液中一直加着G418）。另外，转染后进行有限稀释单克隆的筛选，筛出来的单细胞长成克隆（大约1周）是发光的，但到两周的时候，荧光却消失了。请问这是什么原因？如果我想筛选出整合到宿主细胞染色体中的阳性细胞单克隆，应该怎么筛选？谢谢各位的帮助，并祝新年快乐！！答：我觉得这种情况，应该采用逆转录病毒或慢病毒来转染。我也碰到过类似的情况，直接用载体转染筛选，得到的稳定表达只有40-50%的细胞带GFP，而筛选单克隆时，从单克隆细胞得到的细胞群也是相似的情况，大概只有50%左右ＧＦＰ阳性。我个人觉得，质粒直接转染本身整合率就很低，而且整合也不稳定，所以在每一次细胞分裂时就有可能丢失，或产生错误的整合使得GFP基因不完整插入到基因组中。后来，用逆转录病毒感染后，再用G418筛选，就得到100% 的GPF了，因为逆转录病毒带有整合酶和重复长末端序列，这时的整合应该是不是破坏GFP的稳定性。这仅是我个人的猜测，大家可以

光合作用是地球上最重要的生命现象，它是唯一能把太阳能转化为稳定的化学能贮藏在有机物中的过程，是维持地球上物质循环的关键环节，也是农作物产量形成的决定性因素。在植物科学研究中，经常需要测定光合作用。在光合作用（及呼吸作用）测定方法的发展过程中，曾经有过多次革新，其中包括测定干物质积累的称重法，测定CO2吸收（和释放）的滴定法，测氧气释放的检压法和氧电极法等。与这些方法相比，红外线气体分析仪（IRGA）堪称最先进的方法。它不但快速、准确，而且可将测定信号变为电信号输出，便于仪器的自动化和智能化。近年来，国际上一些生理生态仪器公司生产了全自动光合作用测定仪，如英国PP Systems公司生产的CIRAS-1、CIRAS-2型便携式田间光合测定仪和美国拉哥公司生产的LI-6400型光合作用测定仪，都是当前国际上最先进的仪器，但价格较高。近几年也生产了一些价格相对低廉、适合教学使用的便携式光合作用测定系统，如TPS-1便携式光合作用测定系统（PP Systems公司）。本实验密闭式气路系统以我国北京分析仪器厂生产的QGD-07 或GXH-305型红外线CO2气体分析仪为主机组成的系统进行光合和呼

摘要： 讲述细胞转染技术分类,并分别介绍各种转染方法的原理、应用、特点,及各种转染方法的比较. 常规 转染 技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染（永久转染）.前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于 启动子 和其它调控元件的分析.一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果,常常用到一些报告系统如 荧光蛋白 ,β半乳糖苷酶等来帮助检测.后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体（episome）存在.尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高.外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因）,潮霉素B磷酸转移酶（HPH）,胸苷激酶（TK）等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系. 转染技术的选择对转染结果影响也很

　　1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 　　2、引物长度一般在15-30碱基之间。 　　引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 　　3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm

一、关于如何计算IC50 　　1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 　　 Xm:lg 最大剂量 　　 I:lg(最大剂量/相临剂量) 　　 P:阳性反应率之和 　　 Pm:最大阳性反应率 　　 Pn:最小阳性反应率 举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： 　　 Pm=0.95 　　 Pn=0.06 　　 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 　　 Xm=lg0.1=-1