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15 种常用细胞染色试剂及方法

一、细胞染色常用方法细胞染色常用方法主要包括以下几个:1、简单染色法,常用碱性染料如美蓝等进行简单染色;2、革兰氏染色法,主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程;3、瑞氏染色法,瑞氏染料溶剂主要是由伊红美蓝组成;4、吉姆萨染色法,吉姆萨染色原理与结果和瑞特染色法基本相同;5、细胞免疫荧光染色法,免疫荧光染色的主要原理是利用抗原 抗体之间的特异性结合。 二、十五种细胞染色试剂1、 酸性品红(Acid fuchsin)酸性品红是酸性染料,呈红色粉末状,能容於水,略溶於酒精(0.3%)。是良好的细胞制染色剂,在动物制片上应用很广,在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染,能显示线粒体 。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中,可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用,所以染色过度,易在自来水中褪色。2、 刚果红(Congo red)刚果红是酸性染料,呈枣红色粉末状,能溶於水喝酒精,遇酸呈蓝色。它能作染料,也用作指示剂。它在植物 制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时,能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹

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【共享】分子克隆实验指南(第三版)中文PDF

在美国,有一个叫“冷泉港”的地方,那里被誉为生命科学的圣地,是分子生物学者们神往之处。1982年,一部叫《分子克隆实验指南》的书在冷泉港实验室出版社诞生,它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆讲习班实验方案的汇编。7年后,该书又出了第二版。当时的人们也许未曾料到,这部著作在20年的时间里竟成为指导生命科学前沿科研工作的一部“圣经”。  然而,生命科学的发展突飞猛进,研究技术也是日新月异,昔日的经典似乎已经不能再继续满足大家的需要,人们期待着它的接班者。时隔10年,《分子克隆实验指南》第三版出版了!  《微生物学进展》(Trendsin Microbiology)评述:“《分子克隆实验指南》一直是实验方案和技术领域的中流砥柱。……很难发现前两版《分子克隆实验指南》的错误。数十年来,该书提供的高超的实验室方案使它成为分子生物学领域的黄金标准。然而,在许多实验室,旧版本渐被翻烂,……是该退役安享平静的时候了。新版《分子克隆实验指南》不仅传承了前两版的卓越品质,而且极大地发扬传统,成为当今真正的实验室必备手册。”  《科学家》杂志评述:“任何使用分子生物学技术的基础研究实验室都将因拥有一册

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开发灵敏度高、重复性好的侧向层析诊断产品----第二部分:新方法带来的新挑战

从更多专业领域分析,适合定量诊断分析需要的新技术的开发。侧向层析免疫诊断(LFIAs)作为一种稳定的技术适合在广泛、多样的POC或者现场使用。然而,该技术不能适用于要求非常灵敏、重复性好或者需要获得定量结果的情况。在过去的一些年里,在制作侧向层析诊断产品方面出现了一系列新方法,使得该技术可以用于广泛、多样的更高要求的应用领域。这些革新的方法迫使对LFIAs制做原理产生新的关注,同时研究进行研究、生产所需要的资源,以便成为这个领域内成功的改革者。本文分为两个系列篇,于六月期杂志开始登载。第一篇文章关注LFIAs行业中传统的生产技术和材料,讨论各因素造成的局限性,并且将克服这些局限性的一些方法做了概要,以便制作重复性好的诊断产品。下篇文章关注材料、信号标记试剂、读条仪和整个LFIA观念的新方向,可能开发出更定量化的,灵敏度更高的LFIA产品。伴随这些新方向而来的是一些新的行业挑战。方向趋势 通过这些年重要的大量研发努力,已经发现了克服许多在传统侧向层析免疫诊断产品中材料和设计固有弱点的方法。使用传统的方法手段,对产品设计和生产过程做出仔细的观察,使其可能转化到生产,获得具有低水平信号变异系

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基因转染(磷酸钙-DNA共沉淀法)

磷酸钙-DNA 共沉淀法 核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时,可使DNA 附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA 仅有1%~5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA 可以与细胞DNA 整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA 导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。1、配液 (1)2×HBS 1.63g NaCl1.19g Hepes0.023g Na2 PO4 、2H2 O加水至100ml pH7.1过滤,4℃保存(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌(3)TE:0.1mmol/L EDTA1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。(5)G418选择培养基:用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200~800mg/L注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在10~14天内能杀死细

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实验室“三废”的处理

实验过程中产生的废气、废液、废渣大多数是有害的,必须经过处理才能排放。(一)废气的处理少量有毒气体可以通过排风设备排出室外,被空气稀释。毒气量大时,必须处理后再排出。如氧化氮、二氧化硫等酸性气体用碱液吸收。可燃性有机废液可于燃烧炉中通氧气完全燃烧。(二)含酚、氰、汞、铬、砷的废液处理低浓度含酚废液加次氯酸钠或漂白粉使酚氧化为二氧化碳和水。高浓度含酚废水用乙酸丁酯萃取,重蒸馏回收酚。含氰化物的废液用氢氧化钠溶液调至pH10 以上,再加入3% 的高锰酸钾使CN- 氧化分解。CN-含量高的废液用碱性氯化法处理,即在pH10以上加入次氯酸钠使CN-氧化分解。含汞盐的废液先调至pH8~10,加入过量硫化钠,使其生成硫化汞沉淀, 再加入共沉淀剂硫酸亚铁,生成的硫化铁将水中的悬浮物硫化汞微粒吸附而共沉淀,排出清液,残渣用焙烧法回收汞、或再制成汞盐。铬酸洗液失效,浓缩冷却后加高锰酸钾粉末氧化,用砂芯漏斗滤去二氧化猛后即可重新使用。废洗液用废铁屑还原残留的Cr(IV)到Cr(Ⅲ), 再用废碱中和成低毒的Cr(OH)3沉淀。含砷废液加入氧化钙,调节pH 为8,生成砷酸钙和亚砷酸钙沉淀。或调节pH10 以上

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水分测定中几种常见测试方法的比较

水分测定中几种常见测试方法的比较 1.蒸馏共沸法, 优点:价格也比较便宜,选择性好,适合测量石油类产品。缺点:精确也较差,测量时间长。含水量较大的产品适合。 2卡尔费休容量法, 优点:测试品种多,相对库仑法通用性更好,敏感度不高所受副反应干扰较少,如(如酮类、醛类)。缺点:在最佳状态下仅能测至10-4级;耗材(试剂)大;测定时间偏长。 3.卡氏库仑法 优点:仪器价格中等;耗材少;可以测定至10-6级;时间短,一般物质在掌握好进样量的前提下60秒内即可完成测定,是过程控制和仲裁判定的最佳方法。缺点:由于精确度高,过于敏感有些具有副反应的物质如酮类、醛类测定较困难,需要一定的经验控制反应方向。 4.其他特殊方法:电容/电阻法,适合粗测纸张、木材、粮食等物质;近红外法,适合在线测量大含水量物质;电解(磷酸)法,适合气体的在线测量;压差法,适合测量易挥发物质;露点法,适合测量气体;此外还有浊点法;磷酸重量法;结晶法等不常用方法。 5.传统烘干法,优点:仪器价格低廉,通用性好。 缺点:精度差;仅能测定至10-3级;在干燥蒸馏过程中挥发性物质亦被蒸发,不能测定物质中水分含量的真值

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蛋白质二级结构(secondary structure)(图)

二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象,是多肽链局部的空间结构(构象),主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角等几种形式,它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。 α-螺旋(α-helix)是蛋白质中最常见最典型含量最丰富的二级结构元件.在α螺旋中,每 个螺旋周期包含 3.6 个氨基酸残基,残基侧链伸向外侧,同一肽链上的每个残基的酰胺氢原子和位于它后面的第4个残基上的羰基氧原子之间形成氢键。这种氢键大致与螺旋轴平行。一条多肽链呈α-螺旋构象的推动力就是所有肽键上的酰胺氢和羰基氧之间形成的链内氢键。在水环境中,肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部(α-螺旋内)的氢键,也能与水分子形成氢键。如果后者发生,多肽链呈现类似变性蛋白质那样的伸展构象。疏水环境对于氢键的形成 没有影响,因此,更可能促进α-螺旋结构的形成。 四种不同的α-螺旋 β-折叠(β-sheet)也是一种重复性的结构,可分为平行式和反平行式两种类型,它们是通过肽链间或肽段间的氢键维系。可以把它们想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成,每条纸片可看成是一条肽链,称为β折叠股或β股

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Pyrosequencing技术及其在DNA测序和SNP研究中的应用

DNA 序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA 序列分析技术。在基于Sanger法的全自动DNA 测序技术中,测序反应产生的DNA 片段是荧光标记的,这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离,荧光分子被激发而发光,发出的光信号被检测系统检测。Sanger法的优势在于可以分析未知DNA 的序列,且单向反应的读序能力较长,目前的技术可以达到1000bp以上。在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA 片段进行序列验证,而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下,Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。Pyrosequencing技术是新一代DNA 序列分析技术,该技术对DNA 的序列分析无须进行电泳,DNA 片段无须荧光标记,因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论.一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备

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欧洲分子生物学实验室EMBL简介

欧洲分子生物学实验室EMBL(The European Molecular Biology Laboratory)于1974年由欧洲14个国家加上亚洲的以色列共同发起建立,包括一个位于德国Heidelberg的核心实验室,及三个位于德国Hamburg,法国Grenoble及英国Hinxton的研究分部。由于具有开放和创新的良好学术氛围,EMBL已发展成欧洲最重要和最核心的分子生物学基础研究和教育培训机构。EMBL-DNA数据库于1982年由EMBL建立,与美国的GenBank及日本的DDBJ共同组成全球性的国际DNA数据库,近年来发展很快,在1995年数据量成倍递增。EBI是EMBL在英国Hinxton的分部,主要负责建立EMBL-DNA数据库,可进行核苷酸序列检索及序列相似性查询。EMBL的研究主要集中在以下几个方面:1. 生化实验技术质谱分析(Mass Spectrometry)等。2.细胞生物学(Cell Biology),研究细胞膜上蛋白和脂肪的分布,包括膜运输、微管网络、细胞核及细胞周期,焦点是Rab蛋白。3.细胞生物物理(Cell Biophysics),重点是理论创新和实

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补体旁路途径溶血活性的测定(ACH50)

1、原理兔红细胞不经致敏可激活人补体旁路途径,导致兔红细胞溶解。在反应系统中加入乙二醇双氨基四乙酸(ethyleneglycol-bis-aminotetracetate,EGTA)可和血浆Ca2+螯合,EGTA与Mg2+结合能力很弱,故经典途径被封闭。根据兔红细胞的溶血程度,可测定补体旁路途径的总补体活性。2、所需主要试剂(1)兔红细胞(rabbitredbloodcell,RRBC)悬液的制备 无菌采兔耳静脉或心脏血,用阿氏液抗凝,分装,4℃保存。可用1周左右。试验时取一定量的RRBC,用EGTA-GVD2应用缓冲液洗涤3次,并用该缓冲液配制成3×108个/mL细胞悬液;(2)0.1mol/LEGTA-M溶液 EGTA 38.00g,MgCh·6f102 0.30g,NaOH约7.00g,溶于蒸馏水中,以1mol/LNaOH调节至pH7.5,加蒸馏水至1000mL;(3)0.03mol/LEGTA-GVB2 0.1mol/LEGTA-M 300ral,0.1mol/LCaCl2 5mL,巴比妥缓冲液(5X,NaCl 85g,巴比妥酸5.75g,巴比妥钠3.75g,蒸馏水1500mL

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自制细胞实验的缺氧装置

1.培养板(如96孔等)细胞实验的缺氧装置:[材料]:塑料泡沫盒 1 个;橡胶导管两个;玻璃胶;[注意]:进气孔应该在里下位,出气孔应在上外位(因为通的气体密度较大);导管 与泡沫盒连接处用玻璃胶封好.[方法]:将培养板放入盒子后,盖上盖子,用纸胶封好,然后往里通气(CO2和N2的混合气)10分,接着用止血钳把两个导管夹住密封.最后可以把整个盒子放入37度孵箱内.2.细胞瓶内细胞实验的缺氧装置:[材料]:医用输液器;空气过滤器(过滤空气中的细菌,杂质)[注意点]:严格在超净台操作;进入细胞瓶内的输液器必须保持无菌;输液器与空气过滤器用纸胶封好.[方法]:将细胞瓶直立,用无菌镊子提着输液器出气端,放入细胞瓶内,注意不要碰到贴壁细胞和培养液,然后通气5min,迅速将出气端拿出细胞瓶,盖好瓶盖.【改进】我用直头玻璃吸管插入一次性输液管,这样容易控制方向和深度,也不会碰到瓶壁。不象以前插入细胞瓶的输液管因扭曲不容易掌握方向和深度。丁香园网友CindyGloria的观点为:我们实验室有人做过,我很清楚。而且我早就知道自制的缺点,果不其然,最后还是放弃了。你的问题在于,不实用。具体是:1、塑料泡沫

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胶体电泳法方法步骤

SDS 平板胶片铸造︰1) 整理出两组玻璃片及白板铸胶组合,先用酒精拭净,并选择合适的间隔条(0.75 mm) 组合起来。请熟悉铸胶三明治组合的正确组装方式,以免灌入的胶液漏出来。2) 三明治组合后直立站好,准备所要浓度的SDS 胶体溶液如表4.2. 两片0.75mm 厚的平板胶片约需10 mL 分离胶体溶液,以及5 mL 焦集胶体溶液。APS液到最后才加入,未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的气体。配制两片0.75 mm 胶片所需胶体 (mL)3) 以上分离胶体各成份在小烧杯中混合均匀后,可直接沿着玻璃一侧倒入铸胶组合到预定高度 (约八成高),勿陷住气泡;再轻轻加上一层isopropanol. 也可使用滴管慢慢加入胶体,同样勿注入气泡。4) 约30 min 可凝结,以滤纸吸去isopropanol,同法倒入焦集胶体溶液,要加到满;尽快插入样品槽齿模,注意不可有气泡陷在胶体中。一般在凝胶完成后,胶体与所加的水层的间,会出现清楚的直线界面,但因为背景为白色,较不易观察的。5) 再度凝结后取下齿模即可使用。若不立刻使用,则把整个胶片组合用保鲜膜包好,胶面上方加一水层,勿使干掉,在4℃约可

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大鼠前体脂肪细胞的原代培养操作步骤

1. 乙醚麻醉致死大鼠(3~5 weeks)/小鼠(1~2月,年龄稍大可保证细胞数量)注:1、建议用大鼠做,小鼠取样时,细胞数量偏少,较难养活。2、对于大鼠的年龄,好像要求不太严格,文献上记载一般用3~5 weeks,但我用12 weeks的大鼠做也能成功。2. 75%乙醇中消毒5~15min。3. 无菌条件下取腹股沟部、肾、附睾周围的脂肪组织,用Hanks(Hanks配置较麻烦,用PBS也无妨)反复冲洗3次。4. 用剪刀将脂肪组织剪成1mm小块,置于1mg/ml胶原酶中,37℃水浴(空气)摇床100rpm消化1~3 h。5. 1000 rpm离心5min,去除漂浮的脂肪细胞及培养液。6 .沉积的细胞用红细胞裂解液[2]再次配成细胞悬液,37℃孵育10 min,以去除污染的红细胞。7. 150μm尼龙网过滤,Hanks液洗涤并离心2次,每次1000rpm,5min。注:第六步和第七步我做时省略了。8 .沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液,调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃,体积分数5% CO2培养箱内孵育72hr后换液。9. 一周以后可以传代。细胞的分化 细胞贴壁72 h后

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细胞冻存与复苏技术(二)

复苏技术1. 细胞复苏的原则在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。2. 细胞复苏的主要操作步骤(1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌下取出细胞。(3)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。3. 注意事项在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。

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CTL反应

dna2:我研究重组MVA疫苗,构建了survivin和IL-2重组的MVA病毒,并用病毒感染的DC细胞刺激自体T细胞,进行Survivin特异性的杀伤实验。条件如下:外周血分离单核细胞(体外诱导分化为DC)和T细胞为HLA-A2阳性DC与T细胞1:10刺激一周后重复刺激,并补加IL-2,两周后进行杀伤反应survivin特异性多肽预处理的T2作为靶细胞,非特异性多肽预处理的T2作为对照效靶比为40:1,20:1,4:1 进行杀伤4-6小时现在无法检测到特意性的杀伤,各组的靶细胞死亡率都相当并且很低(不超过30%),不知是什么原因,请教大家应该做如何的改动?我们实验室没有条件做Cr51释放,我都是用CFSE-PI染色或PKH26-annexin V 检测靶细胞死亡。另外,MVA感染的DC与T细胞共培养6-7天时,显微镜下观察和流式检测都发现T细胞有大部分死亡,状态很差。共培养两周后死亡率很高,不知是否正常?感染的DC细胞应先刺激成熟,但不知是感染前刺激还是感染后刺激为好,也不知用什么刺激DC成熟。我用的TNF-a,但效果不好。是否一定要用TNF-a、IL-6、IL-1B、PEG2的co

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HE染色(脱蜡、水化、染色、脱水、封片)

脱蜡 在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时,这样可以使切片粘附更牢固不易脱片,也有利于脱蜡。 二甲苯I 10分钟 二甲苯II 5分钟 切片用二甲苯脱腊,应视不同的季节有不同的脱蜡时间,在夏天,室温较高,脱蜡较迅速,往往在2-3min就可脱蜡干净,二在冬季,时间应相对延长。 切片在进入二甲苯前,可用电吹风吹切片,使切片上的蜡处于熔解状态,这样脱蜡较迅速,尤其是冬天。 在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时,这样可以使切片粘附更牢固不易脱片,也有利于脱蜡。 水化 100%酒精I 5分钟 100%酒精II 5分钟 95%酒精I 5分钟 95%酒精II 5分钟 85%酒精 3分钟 75%酒精 2分钟 蒸馏 水冲洗 1分钟 笔者认为,切片用酒精将二甲苯彻底消除后,在进入苏木素染液前,可用电吹风吹干,这一步对于切片没有充分的烤片时间,对于血块等的切片来说,尤为重要,切片经此步骤,增加了附贴的牢固性,减少切片在染色过程中脱离载片的机会,保证了染色的成

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肝脏细胞RNA的提取

一.原理RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分,也是功能基因组 学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制,已成为分子生物学研究的一个重要手段。对某一生物或组织进行性状研究,首先要获得该性状基因,从组织细胞中分离完整的RNA对于分子克隆 和基因表达分析等实验是至关重要的,如Northern印迹及杂交分析、cDNA合成等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定量的检测,从分子水平精确的了解细胞生命活动的规律。通常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA ,其中80%~85%为rRNA(主要是28S、18 S和5.8 S、5S四种类型);10%~15%为tRNA和核内小分子RNA。这些高峰度的RNA的大小和序列确定,可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析(HPLC)分离。相反,占RNA总量1%~5%的为mRNA 。mRNA 虽然大小和核苷酸序列各不相同,从数百至数千碱基不等,但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾,其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸―纤维素

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可溶性抗原的制备及鉴定

蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原,它们有相当部分来源于组织和细胞,成分复杂。制备这类免疫原时,首先须将组织和细胞破碎,然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原,提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。一、组织匀浆的制备用于制备免疫原的材料必须是新鲜或低温保存的。材料获得后立即去除包膜或结缔组织,脏器应进行灌洗,去除血管内残留的血液,用含0.5g/L NaN3的生理盐水洗去血迹及污物;在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成0.3~0.5cm3小块,加入适量生理盐水,装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后,上清液作为提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前还必须进行离心去除细胞碎片及微小的组织。二、细胞破碎提取细胞的可溶性抗原,需将细胞破碎。根据细胞类型不同,选择破碎的方法也有一定的差异,现介绍几种常用的细胞破碎方法。1、酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件能消化细菌和组织细胞。如溶菌酶对革兰阳性菌的细胞壁有溶菌作用。酶处理法适用于多种微生物细胞的溶解,该方法具有作用条件温和、内含物成分不易受到破坏、细胞壁损坏

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应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价

应用流式细胞术(FACS)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(APBSC)中的CD34+细胞及其亚群,操作简单、快速、重复性好,对及时掌握最佳采集时机,准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及APBSC中的CD34+细胞,本文比较了几种FACS检测CD34+细胞方法的异同。1、材料与方法1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺(CTX)+重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员后的实体瘤患者(淋巴瘤、乳腺癌),采集使用CS3000- Plus血细胞分离机(Baxter公司,美国)。1.2 CD34+细胞的标记 对10份APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。   1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体(Immunotec,法国)室温暗处反应15min,然后用细胞裂解液溶解红细胞,待测。   1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll(相对密度1.007)梯度离心,收集界面层单个核细胞,与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min,待测。1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管,其

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冷冻组织切片上的荧光免疫检验

一、材料与试剂 1. 第一抗体2. 第二抗体(Invitrogen)3. 100%冰冷丙酮4. 马血清(SantaCruz;sc-2483)5. Hoechst 33342荧光染料(Invitrogen;H1399)6. ProLong Gold抗褪色试剂(Invitrogen;P36934)7. 免疫组化笔(Sigma;Z377821)8. 指甲油(FisherScientific;50-949-071)9. PBS10. 甲醛11. 甲醇12. TritonX-100 二、仪器 1. -20°C冰箱2. 湿盒 三、步骤 1. 从冷藏室取出7 μm 的冻干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分钟。注,可选的固定条件依赖于所使用的抗原及一抗。常用的固定剂有甲醛、丙酮及甲醇。2. 用PBS洗涤载片后吸干组织周围的水份,使载片干燥。小心地用PAP笔绕组织圈出轮廓。3. 将切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的马血清溶液在室温下封闭1小时。4. 吸干封闭缓冲液,切片放入湿盒中与含有0.05%TritonX-100的

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