蛋白酶抑制剂类生化试剂 　　破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。 　　PMSF 　　1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 　　2)10mg/ml溶于异丙醇中; 　　3)在室温下可保存一年; 　　4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 　　5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 　　1)抑制金属蛋白水解酶; 　　2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 　　3)溶液在4℃稳定六个月以上; 　　4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml); 　　5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。

整理蛋白版06年2月无人应助贴如下: [求助]蛋白质连接的问题 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5458496&sty=1&tpg=19&age=0 [求助]dystrophin和dystrophin gene http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5458022&sty=1&tpg=19&age=0 [求助]等电聚焦的临床应用（主要在检验医学中的） http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5461205&sty=1&tpg=19&age=0 [求助]MBL抗体的评价如何？ http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5462330&sty=1&tpg=19&age=0 [求助]Con A-Sepharose柱子上样量一般多大? http://www.dxy.cn/bbs

蛋白质提取与纯化技术 选择材料及预处理 　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 　　微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的

随着ICAT的技术日趋成熟，它作为一种较新的定量蛋白组学工具越来越吸引着大家的眼球，勿庸置疑它是定量蛋白质组学的方向之一。版面上之前也有过很多的相关讨论，可以说是非常不错，没有看过的朋友可以参考： 1. 由biodna超版发起的ICAT精华贴: http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=408757&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0 2. codegreen主任进一步的一些思考和见解: http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=429683&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0 3. gougou兄的一些实践经验和大家的讨论: http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1641738&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0 4. 在下的推荐两篇比较2DGE和ICAT的文献 http://www.dxy.cn/bb

还是重磅出击！——Cell杂志评出的10篇文章！全部全彩pdf！ 《细胞》08年11月最受关注的十篇论文 《细胞》创刊于1976年，现已成为世界自然科学研究领域最著名的期刊之一，并陆续发行了十几种姊妹刊，在各自专业领域里均占据着举足轻重的地位。《细胞》以发表具有重要意义的原创性科研报告为主，许多生命科学领域最重要的发现都发表在《细胞》上。11月《细胞》前十名下载论文为： 1. An Oncogenomics-Based In Vivo RNAi Screen Identifies Tumor Suppressors in Liver Cancer 美国冷泉港实验室5个不同的小组联合进行研究，在肝癌中发现了13种新的抑癌基因，研究小组的合作提供了大规模、快速、低花费的遗传筛选，在前期实验中成功发现13种新的抑癌基因。在癌症尤其是肝癌中抑癌基因很重要，经常会发现肝癌患者缺少了抑癌基因。 当发生DNA突变、染色体缺失等改变时抑癌基因带来的好处可能会丢失。Wigler小组几年前开发出一种高效基因测序技术，使得检测癌细胞中可能存在抑癌基因的缺失染色体片段成为可能。 研究人员检测了100

免疫检测法 抗体制备技术 　 抗体（antibody，Ab）是机体免疫系统受到抗原刺激后产生的特异性球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。根据其重链稳定区的分子结构和抗原性的不同，可将为类Ig分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等五大类。由遗传基因决定所产生的抗体，称天然抗体（natural antibody），由抗原激发免疫细胞产生的抗体，称免疫抗体（immune antibody）或称特异地性抗体。人工制备的特异性抗体又可分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。 检测病原体常用的抗体有人工制备的特异性多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。 一、多克隆抗体制备技术 由于病原体或病原体相关抗原分子具有多种抗原决定簇，一种决定簇可激活机体具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，病原体或病原体相关抗原分子刺激机体产生的相应抗体，是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称多克隆抗体（polyclonal antibodies）。 （一）感染或免疫动物 （1）动物的选择：可作病原体或病原体相关抗原感染或免疫的选择对象有家兔、山羊或绵

一直感觉园子里针对Western Blot实验的帖子很多，最近浏览了一下蛋白实验的论坛，看到还是有很多同学遇到各种各样的问题，我就把我们实验室比较成熟的Western Blot实验步骤整理了一下，也挂出来供大家参考一下，希望对您的实验有帮助。 实验步骤： 1.分别配制 5%浓缩胶和12%分离胶 12%分离胶10mL 5%积层胶6mL H2O 3.3mL H2O 4.20mL 30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris HCl（1M） 0.76mL 10%APS 100uL 10%APS 60uL 10%SDS 100uL 10%SDS 60uL TEMED 7.6uL TEMED 6uL 分离胶：分离胶配制完毕即可进行灌胶，灌胶结束后使用ddH2O进行液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝好。（一般要等1.5h） 积层胶：倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干，配制积层胶并进行灌胶，插入梳子

凝胶层析 凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。 （一）原理 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。 （二）葡聚糖凝胶的种类与性能 葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的

1.Principles of Genetics ,Tamarin,7th_Edition. 我从网上找来的，绝对可以下载，非常感谢上传者，也感谢首发者。下载时不可以用任何下载工具，不然下载不了的。 http://rapidshare.com/files/5709290/Principles_of_Genetics__Tamarin__7th_Edition.pdf 2.Working with Molecular Genetics(with solution) Working with Molecular Genetics(with solution)， http://www.personal.psu.edu/rch8/workmg/ 全英文的分子遗传学习题与解答，作为考GRE Biochem练手或者平时学习之用应该很不错的，文件太大，快下，因为不知道连接能保留多久，我刚刚搜索到的，并已下载，感谢原作者！ 3.Microbial genetics:problems and keys http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGen

蛋白质功能预测 一、根据序列预测功能的一般过程 如果序列重叠群(contig)包含有蛋白质编码区，则接下来的分析任务是确定表达产物——蛋白质的功能。蛋白质的许多特性可直接从序列上分析获得，如疏水性，它可以用于预测序列是否跨膜螺旋(transmenbrane helix)或是前导序列(leader sequence)。但是，总的来说，我们根据序列预测蛋白质功能的唯一方法是通过数据库搜寻，比较该蛋白是否与已知功能的蛋白质相似。有2条主要途径可以进行上述的比较分析： ①比较未知蛋白序列与已知蛋白质序列的相似性； ②查找未知蛋白中是否包含与特定蛋白质家族或功能域有关的亚序列或保守区段。 图6.1给出了根据序列预测蛋白质功能的大致过程。由于涉及数条技术路线，所得出的分析结果并不会总是相一致。一般来说，数据库相似性搜索获得的结果最为可靠，而来自PROSITE的结果相对不可靠。 二、通过比对数据库相似序列确定功能 具有相似序列的蛋白质具有相似的功能。因此，最可靠的确定蛋白质功能的方法是进行数据库的相似性搜索。具体的搜索方法可参见第三章，但应记住，一个显著的匹配应至少有25%的相同序列和超过80个氨基

第一章 色谱法概论 1 第一节 色谱法发展简史 1 第二节 色谱法中的一些术语 3 第三节 色谱法的分类 3 一 、根据分离的原理不同进行分类 3 二 、根据流动相的不同进行分类 4 三 、根据支持物的装填方式分类 5 第四节 不同色谱法的应用范围 5 第五节 色谱图的一些术语 6 第二章 蛋白质液相色谱纯化概论 6 第一节 蛋白质纯化的一般目标和方法 6 第二节 液相色谱纯化前的预备工作 7 一 、样品的稳定性实验 7 二 、样品的预处理及保存 7 三 、评价每一纯化步骤： 9 第三节 蛋白质色谱纯化技术理论简介 9 一 、可以用于分离的目的蛋白性质 9 二 、蛋白质的来源 10 三 、常用色谱技术原理简介 10 第一章 色谱法概论 第一节 色谱法发展简史 色谱法(chromatography)又称为层析法、色层分离法。早在1906年，俄国植物学家M. Tswett在研究植物叶绿素时发现不同的色素可被CaCO3吸附，并在用石油醚洗脱时得到分离，这是最原始的液-固色谱法。 但在此后的30年中，Tswett的方法并未得到人们的注意，直到1931年R.

一次认为最无望的化学转化，结果长出70多个转化子。分析原因，有以下几点不同于以往的做法： 我认为关键不同点是以下的2、3、4、6点，但没时间和精力去验证，希望大家给点指示。 1、 质粒酶切与乙醇沉淀等操作比平时长，都大于12h。 2、 乙醇37℃挥发3h，当时怕时间过长质粒降解了。 3、 热激之前的保温和热激温度都比平时高2-3℃，怀疑温度计坏了，歪打正着。以前有次转化长出40多个，温度比较恒定。这次温度又高又不恒定，由此可以排除温度是否恒定不是关键因素。 4、 做感受态时蒸馏水洗涤，由于不做转化有一段时间了，洗涤用水是平时的2倍。 5、 MD培养把108℃×35min错用成121℃×20min，结果MD中的葡萄糖有点焦化，颜色比平时偏深。但这次转化没受影响，感觉培养基不是关键因素，以前没加微量元素的MD板转化子也能生长很好。（第1次转化吸取PEG用200ul枪，应该用1000ul的大枪，吸取量不够，也长出10个转化子，感觉PEG的作用也不是关键因素） 6、 感受态不一样，转接之前的酵母菌菌密度合适，而且放置3-4天。放置1个week，转接转化，只长出3个转化子。以前转接之前

蛋白质构象病 周剑涛 ( 黄冈卫生学校生化教研室，湖北黄州 438000 ) 关键词：构象病；朊病毒；抑丝酶；β-淀粉样蛋白 中图分类号：Q51；R373 蛋白质结构生物学既从蛋白质一级结构序列，也从蛋白质空间结构及其动态变化去研究蛋白质的性质和功能。生物医学研究表明蛋白质空间构象发生异常变化会引起疾病发生，形成了蛋白质构象病(Protein conformational diseases)这一新的病理学概念[1]。 1. 蛋白质构象病及其分子构象病理学 一般讲，引起构象疾病的蛋白质分子与正常蛋白质同时存在于机体内，至少部分蛋白质具有正常折叠的空间构象，并以正常形态释放。当蛋白质构象异常变化时可导致其生物功能丧失，或者引起其后发生的蛋白质聚集与沉积，使组织结构出现病理性改变。 1.1 蛋白质分子纤维化与聚集 (1)血红蛋白(Hb) 红细胞内Hb分子构象异常改变，可致镰形红细胞性贫血、不稳定血红蛋白包含体溶血和药源性包含体溶血。镰形红细胞性贫血由异常HbS引起。HbS中珠蛋白二条β链N末端第6位Glu被疏水性Val取代。在低氧张力下，脱氧HbS因分子表面的疏水或静电作用，分子构象改

56邮箱bio_inf@56.com Quote: 一、生物学中文资料 医学统计软件使用 617.32Kb 数学模型有关知识资料库 4039.87Kb 人工神经网络导论 4075.21Kb 分子克隆及RNA干扰 5198.56Kb 中国草地重要有毒植物_史志诚 29508.91Kb 中国油脂植物 20914.90Kb 分子生物学实验帮助文档 234.57Kb 蛋白质分离纯化指导教材 5084.90Kb 基因工程原理与方法 14456.65Kb 微生物资源开发利用 10561.88Kb 蛋白质电泳实验技术 10375.14Kb 应用微生物学实验法 11911.36Kb 基因工程学原理 12801.99Kb RNAi原理动画演示 52.32Kb 分子生物学(特纳） 11452.88Kb 基因克隆和DNA分析（第4版） 8443.96Kb 细胞生物学教程 6253.92Kb 基因组学、蛋白质组学和生物信息学图片1. 33315.46Kb 基因组学、蛋白质组学和生物信息学图片2. 15145.24Kb 蛋白质结构、分类及预测 5426.98Kb 基因芯片分析的理论与方法 4744.54Kb

物理性质预测： Compute PI/MW http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/pi-tool.html Peptidemass http://expaxy.hcuge.ch/sprot/peptide-mass.html TGREASE ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/ SAPS http://ulrec3.unil.ch/software/SAPS_form.html 基于组成的蛋白质识别预测 AACompIdent http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/aacompi.html AACompSim http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/aacsim.html PROPSEARCH http://www.embl-heidelberg.de/prs.html 二级结构和折叠类预测 nnpredict http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredictPredictprotein http://www.embl-heidelberg.de/predictp

因为自己实验后期需要使用这方面的技术,所以最近在查阅这方面的资料,想拿出来和大家一起分享.后期会把更详细的东西贴出来.英文水平一般,所以翻译的有点差,请海涵. Rac1 Activation Assay Kit被设计来鉴定贴壁细胞或非贴壁细胞的细胞裂解液中Rac活性数量(i.e. Rac-GTP, rather than the inactive Rac-GDP). 使用的glutathione (GST) pull-down方法，采用GST-agarose beads与有的包含74-89 个氨基酸的N末端调节区的部分p21-activated kinase (PAK-1)相结合。PAK-1的这个区域,被认为是p21偶联区域即P21binding domain (PBD),特异性的与活性形式的Rac1相作用,最终提供了一个优秀的工具以分离细胞样本中的活性Rac1. 细胞被镁盐缓冲溶液（ magnesium lysis buffer)所裂解; 接着裂解液需要采用GST-agarose beads (not provided)进行预清除.在这一步，少量的细胞裂解液能够储存起来以检测蛋白的

什么是转录因子？ l 转录因子（Transcription factor，TF）是一类能与特异性DNA序列结合并调节基因转录的调控蛋白。 l 转录因子通常是细胞内信号通路的核心蛋白，是将外界刺激转化为基因表达变化的关键调控者。 为什么要研究转录因子？ l 人体的35000多个基因在不同的组织、不同的时间具有表达差异性，转录因子的调控起到重要的作用。 l 2012年的诺贝尔生理学或医学奖得主山中伸弥，在小鼠成纤维细胞中表达Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4四种转录因子，将成纤维细胞逆转形成多能干细胞（iPS）。 l 转录因子与多种人类重大疾病相关，比如p53、myc、ER、Id与癌症相关；MEF2、HIF1与心脏疾病相关；NFκB与炎症相关；PPAR与肥胖相关等等。 怎样用转录因子研究为论文加“分”？ 加“分”Step1 l 信号通路以及疾病相关的研究比较容易找到转录因子研究的突破口，已有在研项目的研究人员根据自身的研究背景，找准转录因子研究突破口。 l 对于还没有具体研究思路的科研人员来说，转录因子研究相对来说容易出结果、容易发文章，也容易进行深入地探

胶上酶切方法 1． 用1.5mm3切胶笔切下胶点，置于96孔板或1.5ml Appendorf试管中。 2． 用50ul双蒸水洗2次，每次10分钟（如用1.5ml试管, 则用500ul）。 3． 加考染胶色液（50mM NH4HCO3/CH3CN(1:1)）50ul，超声脱色5分钟或37℃ 20分钟，吸干。（若为银染胶点，可以不脱色，也可以加15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色）。 4． 重复步骤３，至蓝色褪去。 5． 加CH3CN 50ul脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。 6． 加10mM DTT（25mM NH4HCO3）20ul，56℃水浴1小时。 7． 冷至室温，吸干，快速加50mM IAA（25mM NH4HCO3）20ul，置于暗室45min。 8． 依次用下列溶液进行超声或混悬清洗: 25mM NH4HCO3（2次）、25mM NH4HCO3+50%CH3CN（2次）、CH3CN(1次),每次10分钟。CH3CN 脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。 9． 将0.1ug/ul酶液用25mM NH4

如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素

蛋白质复性 史晋辉 (天津大学化工学院生物化工系，天津 300072) 关键词：蛋白质复性；环糊精；分子伴侣 重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径。但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难：很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1～3.0μm的固体颗粒棗包含体［1］。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包含体后，溶解包含体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性。这就向生物化学家的蛋白质折叠机制研究提出了新课题。 1. 蛋白质复性机制研究 分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加入变性剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究