Panomics公司的QuantiGene2.0 产品是基于Branched DNA（b-DNA）技术，完成核酸水平的精确定量检测。它克服了传统的real-time PCR（或者q-PCR）技术中的种种不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，对样本量下限无要求（只需mRNA拷贝数在检测范围内），只需将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大即可迅速得到比real-time PCR更加精确的定量结果。除细胞、组织、样本外，该技术对血液样本与福尔马林浸泡、石蜡包埋切（FFPE）同样具有极高的精确度、准确性与重现性。 目前，该技术主要应用于3个平台： 1、QuantiGene® ViewRNA QuantiGene® ViewRNA技术是一套灵敏可靠，行之有效的新技术方案，它可以在原位水平上做到单个细胞单个拷贝数的mRNA或DNA的检测，并能观察同一群体中每个细胞基因的异质表达。据Zhang L等人的报道(Zhang L., Science, 276(5316):1268-1272,1997)，80%以上的mRNAs在一个细胞里的拷贝数不会超过5个，因此QuantiG

Primer Premier 4.10 Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显

请教：高保真酶 关于taq plus 求教Pfu酶作PCR的要求 Pfu扩增求救！！！！ 请问哪一种高保真DNA聚合酶比较好呢？ Pfu DNA 聚合酶的问题 pfu的扩增条件！ 关于高保真酶问题？ 求助：高保真酶 关于高保真酶 关于高保真的酶 pfu高保真酶怎么那么难用？ Pfu DNA聚合酶------常见问题 请教如何做病毒的 pfu 请教Pfu扩增2kb片段 高保真酶咋还不如普通的Taq酶? 请教关于高保真酶问题 哪个公司的长距离TAQ酶好? 请教长片段的PCR克隆技术 求助：大片断PCR 高保真酶和普通taq的混合物扩增的产物有无3端dATP [/url] 有关高保真酶及突变PCR 的问题 pcr产物用于克隆表达未用高保真TAQ酶 求助：在哪买用于做ＲＡＣＥ的高保真ＴＡＱ酶 请教一个关于高保真PCR产物末端加A的问题 请教：如何高保真扩增基因的cDNA全长？ 请问，高保真Taq酶得到的产物是不是不适合TA克隆？ 求助－换了高保真的DNA聚合酶后无法得到预期产物。Why？ 有人用过invitrogen 的 accuprime pfx 高保真酶吗？

精华内容，与EB相关： 电泳问题[精华] [旧贴整理]电泳问题（2） EB的危害及安全问题： ask: DEPC AND EB 的英文全名 请问DEPC和EB的毒性何在 求助：EB有何危害？急！ 求救:EB大量污染的补救措施 PCR中涉及有毒物质的步骤 [求助]琼脂糖凝胶电泳的时候,EB的毒性问题 请问EB是不是多多益善啊 GoldViewTM DNA染料（溴化乙锭的替代品） MSP中的亚硫酸氢钠处理后... 实验用的EB都是怎么处理的呀 EB的配制及使用： 急！向大家求助EB如何配制？ 溴化乙锭的浓度? 急问:已经有配好的0.5UG/ML的EB,该加多少量呢 我想问以下我配40ml的胶,用50ul的EB,应该没什么问题把 请问：如何根据EB的亮度来给PCR产物定量 EB的染色原理： 请问EB是怎样结合DNA? RNA为什么也能用EB染色 请问：变性PAGE跑DNA可以用EB染吗？ 其它与EB相关问题： 请教PCR及EB问题 各位老师:请问为和老是这样? 关于 pcr产物的变化问题 为什麽电泳条带歪歪斜斜 求

友情整理 11月1日～11月15日 零应助贴 求助血清中提取病毒RNA进行扩增 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4774547&sty=1&tpg=20&age=0 [求助]SMART RACE 高手看过来: http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4774641&sty=1&tpg=20&age=0 [求助]求各位帮我看看 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4777508&sty=1&tpg=20&age=0 [求助]求β-actin引物序列 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4777527&sty=1&tpg=20&age=0 [求助]求助，用于RT-PCR的探针可以用来做FISH http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&a

过去的几年里人群中肥胖症患者的比例急剧升高。因此对脂肪细胞---脂肪组织的基本组成单位---功能的研究也不断升温。这其中大多数的研究通过从脂肪组织中提取少量的RNA来检测参与代谢调控的低丰度基因表达水平。 就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定性，这源于实验所用生物系统的不同，RNA提取方式的多样化以及逆转录反应和PCR效率的差异。 所有这些变量都使得实时定量PCR结果难以进行标准化处理。 用于量化qRT-PCR结果的策略不止一种。其中的一种方法是使用标准曲线来推断靶基因的浓度。 最常用的方法是比较阈值法（comparative ΔCT method）,这种方法采用在实验条件下相对表达量不会改变的基因作为内参或参照基因（如GAPDH, b-actin）。有研究表明，如果在对qRT-PCR的数据进行标准化处理时选用的内参不当，这会导致对qRT-PCR数据的错误理解。因此，在qRT-PCR实验时选择合适的参照基

前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从

PCR常见问题总结 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重

这里，很多经常遇到的问题，比如引物设计，PCR 体系和条件，电泳条带分析等，我没有一一详细列举，因为这些原因比较容易找到，我这里列举的可能多是些容易忽略的疑难杂症，希望对大家有帮助。（说了是疑难杂症了，可能有一些看法走极端了，但是为了做出实验，怀疑一切，狗急跳墙，没事找抽也是值得的）。1.引物设计引物的参数合理控制，像发卡结构，错配，二聚体等，只要别太过分，问题应该不大，当然没有最好，个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参数比较重要，让两条引物的退火温度尽量接近，不然后果很严重。2.RNA提取试剂尽量用新的，用自己的，不知道情况的不要用，如果对RNA 不放心，特别是以前提的RNA，重新反转，用RNA电泳一下看看，我直接用DNA电泳的条件电泳RNA的，应该没问题，RNA酶是存在广泛，但还没强到这么短的时间就分解吧（个人感觉的，反正我能跑出RNA条带）。3.反转录如果RNA表达比较少不妨多加点RNA反转；oligodT只反转真核生物mRNA，但是是从3’端开始的，如果你的目的片段在5’端，且目的基因很长，不妨试试随机引物，但随即引物反转的产物95%以上都是rRNA。4.PCR1.操作，快而

PCR的优化 在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。 表1 PCR扩增的疑难解析 问题 解释 补救措施 目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。 无效引导或无效延伸 通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。 应用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反应混合液。 应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%） 目的产物条带在阳性对照管2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。 模板DNA不纯。 重新纯化模板DNA，用酚：氯仿抽提两次，乙醇

OLIGO 是一个从序列文件中搜索和选择寡核苷酸的多功能程序，应用于聚合酶链反应(PCR),DNA测序，定点突变及各种各样的杂交研究。OLIGO根据最近邻热力学值计算寡核苷酸的杂交温度和二级结构。 这个好工具也用于构建合成基因，在已合成的基因中发现适当的序列引物，发现和多元化一致的引物和探针， 甚至发现蛋白质潜在的限制位点。 OlIGO 产品特色：1. 分析TM和内部稳定性，绘制溶解温度图和稳定性图；2. 给出寡核苷酸的重要相关信息；3. 显示正向引物、反向引物和当前的OLIGO里潜在的连接物。潜在的二聚物也可显示出来；4. 分析显示在选中的正向引物或反向引物中基本的成份和溶解温度；5. 精确地分析出生物信息软件中的错配位点；6. 正向引物和反向引物选中后，能自动产生PCR实验条件和PCR产物信息。二、运行所需环境或组件：需要 JRE 1.4及以上版本方能正常使用本软件。三、首次运行或更换计算机后需要进行激活。 步骤如下：1) 运行本软件，在弹出的“OLIGO 7 Customer Registration”对话框中，复制“Workstation Code:”文本框中代码。2) 运

mRNA的分离 与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。 1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。 2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。 3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出

以下是在我查的因物设计要注意的一些问题，和大家共享 PCR引物设计的黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要

北大医学部的新英格兰医学 发信站: BBS 水木清华站 (Wed Dec 15 15:51:58 2004), 站内 基础医学院神经生物学系于常海教授所带领的课题组在SARS病毒早期检测方面取得 突出进展，其研究成果近期发表于国际顶尖医学类杂志《新英格兰医学》（《New England Journal of Medicine》）(2004, 350: 1577-1579)，论文题目为Boostin g the sensitivity of real-time polymerase-chain-reaction testing for SAR S。这是基础医学院迄今发表的影响因子最高的科研论文。 2004 Apr 8;350(15):1577-9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15071137 于常海教授课题组一直致力于分子神经生物学方面的创新性研究。他们已经采 用多种方法来研究单个细胞内不同基因的变化

别人的经验，还不错，大家分享一下吧！ 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因 载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一 个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 b 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于 外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基

实时定量PCR用于基因的定量分离 ——正在兴起的一项技术 前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并不是需要耗费很大的资金。这一篇综述能够通过限制这种技术的多种因素的分析来引导读者。对实验设计，模板准备，分析方法仔细的考虑对于精确的基因定量分析是非常重要的。 正文：在网上通过搜索关键词“定量PCR”或者“实时PCR”可以得到几千个结果，这足可以证明这项技术已经成为许多科学领域的主流研究方向。如果同一个搜索要在几年以前完成，那么得到的搜索结果只有几百个。是什么原因使得运用这种实验技术的论文增加的如此之快呢？第一个有关于实时PCR的文献发表于1993年[1]，那个时候这种实验技术还没有成为主流的实验技术。最主要的原因可能是实验仪器资金上巨大的耗费，而且在运用实时定量PCR研究可增殖

基本PCR引物设计参数 引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。 ①引物长度； 特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。 总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。 ②引物的二级结构 包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于- 5.0kcal/mol

jiangjun82313 wrote: 发表一点不同看法: 1. 相对定量还是有相当市场的, 大家看文献即可知道. 2. 相对定量(2-2deltCt法)需要验证扩增效率, 且扩增效率接近100%. 在你提到的哪篇文章里有: (1+E)-△△CT, 2 -△△CT是当二者的扩增效率接近1时才能得到. 3. 选择一个组织的检验扩增效率就可以, 因为扩增效率主要与PCR条件有关. 4. 是每个组织都要做三个重复,然后取平均值,然后再在一组小鼠的相同组织中取平均值和内参基因相减. 可以分开管扩增(内参基因和目的基因单独扩增,用SYBR One只能如此.) 用探针可以在同管, 但是会麻烦(条件难摸). 5. 目的基因和内参基因转入细菌质粒里,然后抽提,以这个为模板梯度稀释做标准曲线,看二者斜率是否一致,然后判断扩增效率是否一致,这种方法有依据. 有Paper这样做, 还有的用PCR产物为模板梯度稀释做标准曲线. 个人认为用质粒为模板梯度稀释做标准曲线比较方便. 质粒稳定, 易得,浓度高, 纯度高. 做标准曲线一般10X或5X稀释最少4-5个梯度才能做标准曲线, cDNA很难有如此高的浓度,

1．我做的重复样品的标准曲线差别很大，这是什么原因？是不是CDNA样品不纯？ 答复：如果操作正确的话，重复样本是不应该差别很大的。做重复样本时，应当将所有的反应成分都先混合到同一反应管当中，然后再进行分装。这样可以最大限度地降低加样误差和样品混合不匀的问题。您可以尝试一下，如果还有问题的话，可以把结果文件直接MAIL给我们。以便我们可以更直观地了解问题。 2．做realtime pcr的CDNA的浓度是多少？我看到有的文章说是需要先把CDNA稀释到1.25-5ng/ul,是这样吗？ 答复：没有固定的浓度。与您的耙基因丰度有关系。如果丰度低自然就要多一些，如果丰度高，就可以少一下。一般来说都在ng/ul数量级。 3.对每个基因来说，是不是标准曲线只需要用特异引物做一次，模板用什么样的cDNA都可以？用同一模板不同时间作的标准曲线重复性应该是非常好的？ 答复：制作标准曲线最好用带有耙基因片段的质(推荐)或纯化后的PCR产物作模板。不同的cDNA因提取过程中的差异和杂质含量的不同，公导致比较大的差异。如果模板条件无变化，不同时间制作的标准曲线应当是均一的，但要排除试剂的干扰

做RT-PCR可能遇到的一些问题，自己对症下药吧 问 题1. RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 可能原因： 1） RNA被降解 建议： 使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100%甲酰胺中储存RNA 2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS, EDTA, 甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 3）多糖同RNA共沉淀 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 建议： 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。 对于基因特异性引物 (GSP)，可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT) 或随机六聚体，确定GSP是反义序列。 5）起始RNA量不够