概要 本研究考察了粘合剂韧性和塑性流变对片剂硬度、脆碎度和顶裂的影响。使用四种不同的粘合剂，即羟丙基纤维素（HPC）、甲基纤维素（MC）、聚维酮（PVP）和预胶化淀粉，以湿法制粒的方法制备对乙酰氨基酚片（圆形弧面，600mg）。使用3个压片速度在旋转压片机上进行压片。通过径向压缩测试检测纯粘合剂片和对乙酰氨基酚片的性质。使用荷载-形变曲线下的面积衡量韧性。HPC显示出最强的韧性。HPC和MC粘合剂片剂的破裂很光洁。PVP和淀粉片剂出现顶裂和中部随机的裂纹。即使在达到最大荷载的80-90%的情况下也未观察到片剂有微裂现象，说明大部分的破裂出现在接近断裂荷载的时候。这些结果同样表明，韧性强的粘合剂有着较大程度的塑性流变，可以降低片剂的脆碎度，并帮助改善生产速度和压片力。 前言和目的 使用材料科学的方法定性研究药用辅料的特性有助于设计药物的处方，从而达到所期望的性能特点。对片剂而言，更好的理解物料本身以及与其它成分结合时的压缩特性有助于开发出更理想的处方和产品。基于这一思想，本文研究了粘合剂韧性和塑性流变对压片速度和片剂物理性能的影响。 实验 使用4种不同的粘合剂制备对乙酰氨

PCR 引物设计及软件使用技巧 张新宇，朱有康，高燕宁 （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021） 摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详 细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性 引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 关键词：PCR；引物设计 中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号： 1 自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研 究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不 合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚 体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得 到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。

PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 　　为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。

对于作PCR的来说，最难的莫过于设计引物了，理论现在已经很多了，但是真正实践起来是要付出一定的心智的，记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物，从没有失手的时候，真是让我佩服得五体投地。 最近看了一下OLIGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design. 下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧： 1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一般扩展名为 .seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，可以从window菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。 2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗 3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小

RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1]做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2]RT按要求做，一般不会出太大问题。? 3]PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？ 必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random primers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov 问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中

标准的PCR反应体系： 　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul 　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L 　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　 　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L 　　　　　　 加双或三蒸水至 　100ul 　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的

IPrime为您提供的专业服务，满足各种科研和诊断的需求。我们承诺保证引物工作。因调查需要，现提供第一对引物免费设计的优惠。 有需要的朋友可填写表格(附件），将基因信息及引物设计的详细要求，以邮件的形式发送给我们。需要免费引物设计的朋友请使用学术机构域名下的邮箱地址与我们联系：liu.jun(at)yale.edu 如需更多引物设计，请查看附件中的相关引物服务列表。 详细服务内容如下： 1. 普通PCR引物设计 2. Real-time PCR引物设计 3. 转录因子，结合序列，转录调节区，启动子的引物信息设计 4. 转录因子，结合序列，转录调节区，启动子的引物信息提供或设计 5. 表观遗传学，外基因学研究相关的引物信息提供或设计 CpG island primer sets for regular PCRCpG island primer sets formethylation sensitive PCR CpG island primer sets for methylation specific PCR CpG island primer sets for me

第一节 概 述 　　从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。　　一、RNA制备　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手

实时荧光定量PCR ——一种科学准确的定量方法 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 图1. Ct值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系

TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质 TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DN

实时定量PCR应用中的问题及优化方案 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测 荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实

PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被

原有战友发过，但发现链接基本已失效，现重新上传，有需要的战友请下载（本楼的4个附件要叮当，后面的免叮当）。 下面是转载的书籍介绍： 内容简介 miRNA能抑制其他基因的表达，并且参与众多的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、细胞分化和发育。 本书介绍了miRNA的基本概念：阐述了关于miRNA预测筛选、分离和测定的多种先进的技术和方法：提供了包括在植物、线虫、果蝇、鱼、鸡、小鼠和人类等一些物种中使用的多样化、新颖和有价值的miRNA技术、并且说明了作为潜在的药物设计工具如何使用这些技术研发miRNA。另外，还对基因调控、小RNA功能、RNA干扰机制和转基因遗传学等内容进行了介绍。 本书对每种方法都提供了step-by-step的实验指导，每种方法均概述了原理，列出了所需的仪器设备和试剂，提供了实验步骤，并对实验中的疑难和如何避免失误进行了提示。 本书包括：最新、最先进的miRNA研究方法和技术，易于掌握的体内、体外miRNA功能测定方法，利用miRNA技术制作的转基因动物模型。计算机分析预测miRNA和miRNA分离技术，疾病分子发病机制和设计新治疗策略的研究进展。 目录 第1章

[求购]请问哪里可以购rat heme oxygenase-1（rHO-1）的全长cDNA？ http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5598968&sty=1&tpg=7&age=0 [求助] http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5570022&sty=1&tpg=12&age=0 [求助] http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5542551&sty=1&tpg=15&age=0 [求助]【求助】interleukin RT-PCR http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5625101&sty=1&tpg=3&age=0 [求助]【全血提取RNA，帮帮忙啊！！】 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5530938&

确诊丙肝 　　目前全世界有近2亿丙肝病毒感染者，我国受感染者就达6000万。由于至今缺乏有效的预防和治疗方法，早期诊断是防止丙型肝炎病毒传播的有效手段。1993年，我国研制成了第一代丙肝检测试剂，但经过多年临床应用，时有漏检现象发生，2003年，科研人员利用新的思路和技术攻克了困扰医疗界多年的问题，研制成了我国自主知识产权的丙肝确认试剂，使广大受血者免受丙肝病毒感染。 　　1988年春，一场空前的甲肝大流行突然袭击了中国上海，这次突发的传染病使许多人第一次领教了甲肝的可怕。但与此同时，人们对另一种危害更为严重的肝炎病毒还一无所知。军事医学科学院基础医学研究所的马贤凯教授清楚地记得，那个时候只要做大手术 , 病人一旦大量输血，手术后往往出现转氨酶升高，继尔会患一种肝炎。1975年，人们就发现了这种通常是输血后感染的肝炎。由于无法确定病因，这种肝炎就被人们无奈地称为非甲非乙肝炎。 　　1989年，美国科研人员利用最新的分子生物学技术首次从基因水平鉴别到非甲非乙病毒基因组结构，发现90%的非甲非乙肝炎都是由同一种病毒引起，这种病毒被正式命名为丙型肝炎病毒。 　　丙型肝炎目前还没有有效

PCR 引物设计及软件使用技巧！ 自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得 到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。 引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定

光度计测量的转换: 双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液 单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液 RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液 参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536. 核酸分子量计算方程式： 吸光度(A)＝摩尔消光系数×浓度×长度 500 bp的双链DNA＝325,000 Daltons 500 nundefined的单链DNA＝162,500 Daltons *nt = nucleotide dNMP的平均分子量＝325 Daltons 寡聚体定量： 20-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：5 nmol = 33 µg/(20×325) 40-mer，A260 = 1

最近一直专注于简并引物的设计。从园子里和其他地方学习了不少，终于也设计出了满意的简并引物。现将全过程一并贴出，以供大家学习交流用。 所用软件：DNAMAN， FastPCR，在线Blockmaker (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html)，在线Codehop (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html). 我所要研究的是与鱼类性别分化相关的基因dmrt1。这个基因的蛋白质在整个动物界里算是保守的。在鱼类里相当保守。我研究的这条鱼还没有基因的报道，所以没有基因序列可用，只能借助于保守序列设计简并引物来研究了。 1. 在NCBI里查找dmrt1核苷酸序列，挑选一些与研究种亲缘关系较远及较近的序列（比如人、鸡、蟾，然后一些模式动物如斑马鱼等，然后一些亲缘极近的种），找到每一个序列的cds，点击进入蛋白质序列（因为核苷酸序列一般不保守，蛋白质序列才是保守的）。将各个蛋白序列存为fasta格式，或者直接复制到

做了快一年的SYBR G的定量实验了,有一些心得,写出来大家交流下. 也是今天在学校的BBS上有人推荐这里的,觉得很不错. 我们用的机器是ABI 7900,我自己比较喜欢的试剂是ABgene的QPCR sybr ROX MIX. undefined试剂我一般再进行稀释一倍后使用,反应总体系是10ul. 用SYBR G来做的话,引物非常重要. 我设计引物使用Primer 5,一般选择上游引物跨最后和最后第二个外显子,下游引物在最后一个外显子中,实在找不到,可以前移,但是一定保证至少一条引物跨外显子。跨外显子有个很大的好处，就是如果你拿到引物后，可以用DNA来做下子看看，如果扩不出来，那么抽完的RNA就可以不用DNA酶处理，直接反转录了。（说实话，一般DNA酶处理的时候，RNA也会伤血的，所以不处理的话，RNA本身也会快乐很多） 设计好后绝对不能有杂带,dimer可以容忍,但是AG不能低过-6.0. 满足了这些条件后,Tm值两条引物要统一在60度,可以在5'末端加一两个碱基的错配进行引物温度的均一化. 设计完要记录下产物的长度和Tm值,用于以后核对.一般产物的Tm值在85到90左右比较好,太低的话会

各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！ 提取技术虽然不说了，但是我可以告诉各位如何准确确认RNA质量的有效方法（可能是最简单而有效的，如果你已经知道了，也请你不要笑话我孤陋寡闻了！） 以下两种方法，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RN