动物造模 | 小鼠动脉粥样硬化模型构建

粥样硬化型心血管疾病（Atherosclerotic cardiovascular disease，CVD)是当前人类面临的主要致死性疾病之一，也是当前心血管疾病研究热点，动物实验是研究和探索治疗心血管疾病途径必不可少的环节。

 

常见动脉粥样硬化动物模型包括Apoe敲除小鼠、Ldlr敲除小鼠、在其基础上调控其他基因的品系以及其他基因调控方式调控相关基因的动物模型（表1）。

 

表1.不同动脉粥样硬化小鼠对比

 

Pcsk9D377Y在动脉粥样硬化模型小鼠中的应用

 

转基因动脉粥样硬化模型小鼠在是实验上存在一定的限制，如没有相关课题时需要一直保种饲养，随后，大量繁殖集齐数量足够年龄相近的小鼠也需要时间，近年来，科学家们建立了一种快速、简便、通用和经济有效的、利用病毒注射野生型小鼠的造模方式：AAV9-Pcsk9D377Y尾静脉注射。

 

Pcsk9D377Y过表达是近几年新出现的动脉粥样硬化急性模型之一。前蛋白转化酶枯草溶菌素转化酶9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, Pcsk9）主要由肝脏表达，介导一些受体的降解，在胆固醇和脂肪酸的代谢中起到重要作用。

 

Pcsk9能与肝细胞表面低密度脂蛋白受体 (low density lipoprotein receptor, LDLR) 结合, 构成复合物并靶向转运到溶酶体内进行降解, 从而阻断LDLR在细胞膜表面的循环途径, 抑制低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoproteincholesterol, LDL-C) 通过LDLR转运从体内清除代谢, 使得血浆中LDL-C升高, 最终导致动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 的形成1,2。过表达突变的Pcsk9D377Y，能加速LDLR的降解，严重影响血浆中LDL-C的清除能力，最终导致高脂血症。因此我们利用这原理，以AAV作为过表达Pcsk9D377Y的载体，使用APOE的启动子确保能在肝脏中特异表达，诱导野生型小鼠产生动脉粥样硬化，AAV结构如图1所示。

 

图1. AAV9-Pcsk9D377Y示意图

 

该模型的构建方法也十分简单,AAV病毒进入循环系统后能倾向于在肝脏中富集，因此，病毒的递送至肝脏十分简单。构建模型时，野生型C57小鼠通过尾静脉注射即可构建成功。

 

该产品使用的APOE启动子是肝脏载脂蛋白的增强子嵌合抗胰蛋白酶的启动子构成的肝脏特异启动子ApoEHCR-hAAT，可以确保病毒的作用局限于肝脏细胞，防止Pcsk9作用其他细胞产生实验的干扰。配合汉恒高滴度的纯化技术，病毒滴度可达到undefined10^13v.g./ml，在保证注射的病毒颗粒数量同时极大的减少尾静脉注射的体积，减少动物的伤害。

 

总之，这种方法构建的动物模型十分简便，见效快，而且效果能维持很久3，不需要繁琐耗时的转基因小鼠的配种，极大地缩减了实验流程。

 

AAV9-Pcsk9D377Y注射诱导动脉模型的详细流程：

 

01

   小鼠饲养

 

 

小鼠的饲养应在SPF的级别或其他学术界公认的条件下饲养，必须经由有关专业培训的饲养员管理。

整个实验流程小鼠应处在稳定受控的培养条件，包括21°±2°C, 50%±10%相对湿度，12小时光照和12小时黑暗循环饲养。

小鼠在手术前一周能随意获取,并有充足的标准的饲料；

02

  AAV注射

 

 

每只小鼠尾静脉注射1X1011v.g.以上总量的PCSK9 D377Y过表达病毒或对照病毒，使用生理盐水将两种病毒稀释为相同体积，且总体积不能超过150μl，注射后使用WD饲料或Paigen饲料饲养12周左右；

 

 

 

Pcsk9D377Y过表达AAV现货供应

 

汉恒生物拥有人源、鼠源Pcsk9突变体过表达腺相关病毒（AAV9-CMV/APOE-Pcsk9D377Y），供动脉粥样硬化研究者造模使用，现货供应，质量有保证。详情垂询【400-092-0065】。

 

1、Schulz R, Schlüter KD, Laufs U.Molecular and cellular function of the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) [J].Basic Res Cardiol, 2015, 110 (2) :1-19.

 

2、Seidah NG, Sadr MS, Chrétien M, et al.The multifaceted proprotein convertases:their unique, redundant, complementary, and opposite functions[J].J Biol Chem, 2013, 288 (30) :21473-21481.

 

3、Kumar S, Kang DW, Rezvan A, Jo H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2017;97(8):935-945.

 

 

小提示

 

使用AAV9-Pcsk9-D377Y构建动物模型可以选择联合部分颈动脉结扎术（PCL），快速诱导斑块的形成，虽然说动脉粥样硬化是是多种因素共同诱导的疾病，但是血流紊乱区域常常是动脉粥样硬化开始发展的地方。这样也使得小鼠的病变的位置变得可控，对模型的影响更加单一，减少其他因素的影响。部分颈动脉结扎引起的动脉粥样硬化的分子机制与人动脉粥样硬化易发区域(如主动脉弓小曲)观察到的分子机制也是相同的。一般在病毒注射一周后，小鼠接受PCL手术（具体流程参考文献PMID: 20613706），术后小鼠继续HDF饲养3周后取材，评估研究对象对动脉粥样硬化的影响。