定量PCR的应用与开发

™1.应用开发指南

™2.引物设计软件

™3.实验设计思路

™4.技术应用举例

应用开发指南

应用开发基本流程

•探针设计指南
–免费赠送Primer Express软件
–TaqMan探针Tm68ºC -70ºC
–MGB探针Tm65ºC -67ºC
•引物设计指南
–引物Tm58ºC -60ºC
–短PCR产物50-150bp
•PCR程序指南
–通用的PCR条件 2步法：95ºC @15sec, 60ºC @ 1 min
•实验条件快速优化指南
–所有实验在同样条件下完成
–固定的PCR 试剂 浓度2X TaqMan®Universal PCR Master Mix
–只需简单优化引物/探针浓度

引物设计指南
1.先设计探针，再设计引物；
2.引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠；
3.G-C含量保持在30-80%之间；
4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；
5.用Primer Express ^® 软件计算出来的Tm值应当在58-60 ℃之间；
6.在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。

为什么要避免3’端的G和C？
Design rule:5 nucleotides at the 3" end have only 1-2 G+C’s

Transient binding at 3" end of probeis quickly stabilised by the DNA polymerase