实时定量PCR技术在恶性肿瘤诊断中的应用

背景：生物科学和有关技术的发展为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了分子学依据。当前，外科病理学主要依据肿瘤的解剖特点（如：转移瘤）和组织病理学对恶性肿瘤分类。微阵列连同聚类分析揭示了肿瘤分子的差异多样性，靠这一点有望建立一个新的与预后有关的分类方法，更重要的是，对疗效有重要的意义。病理学上的挑战将成为常规临床应用分子学分类的发展和补充。

方法：本文重点放在临床实验室中用以DNA为基础的PCR技术来了解实体肿瘤的概况，并讨论这种技术的意义、发展和可能性。

内容：分子标志物可以为我们提供准确的预后和机体对治疗的反应、耐药性和毒副作用。由于与肿瘤恶性有关的基因改变的多样性，要得到肿瘤完整的特征，需要进行各种实验。一些新的肿瘤分子学分类是以基因表达为基础的，需要在标本的处理过程中保持RNA的完整。更多稳定的分子标志物（如DNA和蛋白）在临床实验室中广泛应用。实时定量PCR可以测定基因的重复和缺失。另外，PCR后立即进行熔化曲线分析可以辨别很小的突变和甚至单个碱基的变化。这种技术变得越来越简单和快速并且可以进行多重测量。进行肿瘤标志物分析，实时定量PCR技术无疑是一种有利的选择。

总结：将最近在肿瘤学方面的发现介绍到临床应用中是很有必要的。这需要客观的、完善的、合算的分子技术用于临床试验，最终用于常规检测。实时定量PCR在实验室对肿瘤特性研究的应用前景诱人。

现在大部分人类基因组的序列可获得，可用于了解、定性和治疗复杂疾病如恶性肿瘤。对肿瘤的形态和临床表现不同等生物学差别，可以利用基因表达芯片、比较基因组杂交、原位荧光杂交、Q-PCR和突变分析等来分析。通常许多因素可以破坏正常细胞的调控，其中包括：病毒感染、DNA甲基化和基因序列改变。当这些因素影响到调控细胞分化、修复、凋亡和血管再生的基因时，肿瘤就发生了。当前的分子学技术已成为研究肿瘤生物学和发现导致肿瘤的内在和外部因素的有效工具。

微阵列连同聚类分析可以破译和比较分析生物系统中全基因组表达模式。分层收集不同条件下基因表达的微阵列数据。

利用微阵列分析，研究者已经根据基因表达的不同对许多恶性肿瘤进行分类，例如：淋巴瘤、白血病、肺癌、遗传性及散发乳腺肿瘤。每一种肿瘤在其进展过程中都有一明显特征，显示其分子生物学历史。基于标本中的每一个细胞类型独特的表达特征，可以对肿瘤组织进行分子水平的解剖。例如：在乳腺肿瘤中，标本中的乳腺肿瘤细胞的特异基因表达能将其与其他细胞，如淋巴细胞和基质细胞区别开。另外，组织学分类中的分子亚型细胞也能区分。例如：慢性B细胞淋巴细胞白血病有两种类型，弥漫性大B淋巴细胞瘤有两种类型，非小细胞肺癌有五种类型（包括三中腺癌），侵入性导管细胞乳腺肿瘤至少有四种分子学类型。这些分子亚型很重要，因为可以利用它们来预测病人的结局和解释解剖诊断一样的肿瘤在自然转归中的变化。

还可以从肿瘤相关的突变得到各多的信息。基因表达谱有时可以反映特定基因的突变。

目前为止，在人类肿瘤中最普遍的突变是抑癌基因的突变如：p53。、50%以上的恶性肿瘤存在p53基因突变，在头、脖、肺、皮肤、膀胱和结肠癌中尤为常见。p53突变与肿瘤的侵袭生长的组织特征、早期浸润和耐药有关。在乳腺癌中p53的突变率为20%-30%。多变量分析表明p53突变是乳腺癌对他莫西分治疗反应差的一个独立的预测指标。核酸技术在检测p53状态上比免疫组织化学（IHC）法好。在许多肿瘤中，IHC检测的p53与突变的状态有关，但是一致性差。在外科病理学中IHC是一个检测分子标志物的简单方法，但是它易因抗体特异性的不同、评分的标准以及贮存因素而发生变化。另外，核酸技术还可分析治疗反应相关特异突变，为残余疾病提供分子标志物。

在病理学中对实体肿瘤标志物的需要是很明确的。但是怎样用好这些新的实验方法是不确定的。例如，为了保持组织结构的完整性，要将标本用福尔马林固定石蜡埋片。但是这样将会导致mRNA的回收不可靠。因此，用微阵列分析或者逆转录来进行表达分析是不可行的，除非我们改变实体肿瘤标本的保留方法。DNA和蛋白质标志物在结构上比RNA标志物稳定，可以在外科病理学中利用这些标志物来确认突变的状态和基因的表达。

定量分析

IHC是一种针对蛋白质表达的半定量技术，解剖病理学家可以用光学显微镜来分析。IHC很经济，而且检测标志物同时可进行组织学评价，但它是一种很容易出现错误的方法。这一点在计算乳腺癌中HER--2蛋白的过量表达中尤其明显。HER--2阳性表明有肿瘤恶化和预后差。曾提倡用以IHC为基础的检测HER--2蛋白的“HercepTest”用于预测对“Herceptin”的反应。但是它很难区别背景染色和弱阳性结果。

另外，不同的商品化抗体可以产生不同的结果。因HER—2 IHC有困难，所以大多数实验室用FISH法来代替它来检测HER--2基因的扩增。FDA批准了两中FISH方法用于检测HER—2。两种FISH法有很好的一致性，但是同IHC一致性很差。HER—2检测的这一经历突出了实体肿瘤分子分析中实验的相容性和可靠性的要求，随着更多标志物的出现和应用，这种需要将更迫切。

实时定量PCR

实时定量PCR技术的进展与微阵列技术同步。这种技术是均质方法，它包括扩增和分析，不需要铺凝胶，无放射性以及样本处理。现在有不少可用的商品化平台，即可以检测荧光的热循环仪。PCR过程中，检测每一个循环中DNA染料或探针的荧光强度。达到一定循环数，产物的聚集使其荧光强度超过了背景。这一点量化为第二衍生最大值（交叉点Cp），Cp同初始模板的拷贝相关。

初始模板拷贝数多，荧光出现早，Cp值低。可以根据Cp值的不同来判断两样本（实验和对照）的相对拷贝数。因为PCR是一个指数过程，相对拷贝数等于PCR效率的△Cp次方。由于难以得到不同样本中的DNA总数量，通常用假定不变参考基因对检测基因的结果标准化。对给定肿瘤基因组稳定区（如未变）可以用CGH来确认，用作DNA的质控。一种经济和常用的替代微阵列分析的方法就是实时PCR的相对定量法，它是利用SYBR Green I做双链DNA产物的荧光指示剂。

Cp值和初始拷贝数的关系和利用Cp值和初始拷贝数计算PCR扩增效率的方法见图2A，B。PCR扩增曲线利用血清中蛋白的特异探针产生。白细胞DNA基因组浓度10倍系列稀释物的。对每一个稀释度以每个循环的荧光强度和循环数为参数来作扩增曲线。以DNA基因组的对数和每一个稀释物的Cp值做回归直线来计算PCR反应的平均效率。这个效率可以用下面的公式计算。直线的y轴截距表示最低检测限。

用多重实时PCR进行诊断

实时定量PCR可以在单一反应中同时测多个基因。多重检测最主要的优点是，它提供内标，降低试剂成本以及保存珍贵标本。在分析微解剖组织标本的多个目的基因时，多重分析显得尤其重要。因为正常二倍体细胞中的DNA可以干扰基因的拷贝数，需要对实体进行肿瘤微解剖。从微解剖组织中提取核酸的方法已建立。HER-2和TOPOⅡα的DNA定量分析对乳腺癌的预后和治疗意义重大。约有20%的乳腺癌HER--2基因在DNA水平上扩增，导致蛋白信息增加和蛋白的过量表达。topoIIα基因位置邻近HER-2基因，定位于染色体的17q12- q21，此区在乳腺肿瘤时频繁出现突变。HER-2DNA扩增可伴随topoII的变化（扩增或缺失），topoII的拷贝数可以影响抗topoII药物的治疗效果。

用三色PCR反应同时检测HER-2和topoII基因相对于控制基因白蛋白基因的初始拷贝数。三组相近的探针中与荧光素配对的染料分别为：HER-2—LCRed640，白蛋白—Cy5，topoII—LCRed705。每一个对象由不同标记探针发射的荧光来鉴别。这些染料产生的波长的重叠区用软件处理，得到每个探针的特异信号。实验中用多重反应来确定每一基因的扩增效能。如果三个对象存在相同的拷贝数和扩增效率，三者将会有相同的Cp值。图三比较了野生型白细胞基因组DNA和乳腺癌分离的DNA扩增。同预测的一样，野生型DNA基因组中三者的Cp值是一样的，但是在肿瘤标本中HER-2和topoII的Cp值的变化比控制蛋白早出现。这相当于这些基因八倍扩增。用CHG和cDNA芯片分析发现在这个肿瘤标本中有这两种DNA的扩增与mRNA的过表达。

突变分析

用实时PCR检测实体肿瘤的突变

DNA突变包括重排如转位、倒置，基因扩增和缺失，以及一些小的变化如点突变和碱基的插入和缺失。较大的变化一般出现在血液恶性肿瘤中，通常用细胞遗传学技术如FISH等分析。而小的变化通常出现在癌中，可用于临床常规检测实体瘤中小的细胞体突变的方法很少。

体细胞突变在许多肿瘤发展过程中出现，而且对恶性肿瘤的进程有重要的影响。抑癌基因p53突变在人类肿瘤中最多见。约有90%的p53突变是发生在DNA结合区（外显子5~8），其中87%为单碱基改变。外显子5~8的突变是最好的转归指标。研究表明p53的热点突变，如273密码子，可能导致对anthracycline的耐药性，而anthracycline是治疗转移的乳腺癌的首选药物。p53突变可以用来监测复发和治疗效果。例如：肿瘤细胞死亡后p53核酸释放入血，可以检测病人血清的p53核酸。对突变DNA的检测（甚至定量）可以用来定期监控。尽管p53的价值很大，对其是否用于临床常规检测仍有争议。原因在于不同检测方法的结果相矛盾，也没有可用于临床实验室的能弥补这一矛盾的技术。

许多筛选方法和直接测序都用来确定基因型和疾病的关系。突变可引起单链构象和异源双链二聚体融化的改变，常规检测方法利用凝胶来解析由此导致的迁移率的转变。凝胶技术利用二聚体稳定性的不同来区别同源和异源双链二聚体，这些技术包括变性梯度凝胶电泳、连续变性凝胶电泳和短暂温度梯度凝胶电泳。或者，用化学方法或者酶消化，凝胶片段分离的方法来检测异源双链二聚体。检测方法的发展包括单链构象多态性分析与荧光相结合和使用变性HPLC。具有快速、灵敏度高、经济的体细胞突变检测方法将会在临床实验室中得到最大限度的应用。

在临床实验室中经常用荧光杂交探针对同种基因分型。例如：应用杂交探针的溶解曲线分析和来检测引起一般遗传性疾病的基因的微小生殖细胞突变/基因多态性，这类疾病有胆囊纤维化、静脉血栓、肺气肿、血色沉着病、和高胆固醇血症。溶解曲线分析和结合SYBR Green I可用来检测DNA甲基化，DNA甲基化导致转录沉寂。另外，单标记探针的溶解曲线分析能用来筛选体细胞突变。图四显示一组与野生型p53序列互补的荧光标记的有重叠序列的寡核苷酸探针检测两种不同的大肠癌中p53在6 exons和8exons上的突变。将探针设计为实验对象退火时荧光强度减少，这是因为脱氧核糖核苷的淬火作用。在循环仪中扩增后，仪器进入溶解程序，首先反应温度下降探针与靶结合，之后缓慢升温（0.10C/s），同时连续监测荧光强度。通过特征性野生型溶解曲线的变化来鉴别体细胞突变。对未突变和突变克隆恶性肿瘤的溶解曲线进行比较，异常溶解峰的出现或者峰区比值的变化表明对应探针的序列变化。在同一个管中可应用多达三个探针进行多重溶解曲线分析，筛选~100bp 的区域。

概括

目前恶性肿瘤的研究焦点在新的分子标志物的重要性上。在外科病理学中分子标志物和组织形态学的联合将提供更精确的预后。另外，肿瘤的分子学定义可用于指导治疗和检测残留病。

今天用于肿瘤研究的技术，如表达芯片和CGH，可以进行基因组范围的筛选和发现与肿瘤有关基因的变化。表达芯片可以用来确认同等调控基因，确定解释肿瘤之间不同临床表现的途径。CGH可以用于鉴别全基因组范围内的肿瘤发展过程中DNA的扩增或缺失的具体区。把这些技术联合起来，能够在多重分子水平上进行确认。例如CGH确认DNA在染色体7q处扩增，表达芯片显示，这包括HER-2,Grb-7,和topoII的复制子。在DNA水平上的靶基因的鉴定，允许使用福尔马林固定石蜡包埋的组织块。同时也适合现行的病理标本制作流程。表达芯片分析和CGH是发现肿瘤之间不同和癌变机制的强有力的工具。在不久的将来，肿瘤将会在导致肿瘤细胞分化和转移的生物学路径的基础上被定义和治疗，而不单单基于组织学表现。

可用于临床分子学分析的平台仍在改进。表达芯片分析和CGH对了解肿瘤的生物学特性很有效。然而，一旦肿瘤基因和控制基因被确认，这些方法用于临床诊断是不必要的。实时PCR在临床检测中的作用将越来越大，它可用于检测基因表达，基因扩增或丢失，以及小的改变（如点突变）。此外，它可用于检测和定量肿瘤的病毒因素，如EBV和HPV。实时PCR客观、快速、应用范围广、经济，可检测微小的组织标本，因此在分子诊断中的应用前景诱人。