细菌中蛋白质的提取与纯化技术
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一、实验试剂
采用T7 Tag Affinity Purification Kit
T7 Tag抗体琼脂。B/W缓冲液:4.29 mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137 mM NaCl,1%吐温-20,pH7.3 洗脱缓冲液: 0.1 M柠檬酸,pH2.2 中和缓冲液:2 M Tris,pH10.4。 PEG 20 000。
二、实验步骤
1. 100 ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5 000 g×5 min,弃上清,收获菌体,用10 ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心 14 000 g×30 min,取上清液,0.45 μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7 Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10 ml B/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。
6. 用5 ml洗脱缓冲液过柱,每次1 ml,洗脱液用含150 μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24 h,中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
三、注意事项
蛋白在过层析柱前,要0.45 μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。