Preparation of Agarose Gels for DNA separations
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Weigh out the desired amount of agarose and place in an Erlenmeyer flask with a measured amount of electrophoresis buffer, e.g. for an 0.8% gel, add 0.8 gm of agarose and 100ml of TBE Buffer (1X), to a 200 ml flask. The larger flask insures against the agarose boiling over. Dissolve the agarose in a boiling water bath or in a revolving-plate microwave oven. All the grains of agarose should be dissolved and the solution clear. Cool the solution to 60°C (70°C for concentrations 2% or above) and pour immediately. Allow the gel to set for one-half hour before using. Make sure to use the same electrophoresis buffer in the gel as for the running buffer.
DNA Size Separation by Agarose Concentration
| <center> <font><font><font>Effective Range of Separation <br /> for Linear Fragments<br /> (kb)</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>Agarose<br /> (%)</font> </font></font></center> |
| <center> <font><font><font>30 to 1</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>0.5</font> </font></font></center> |
| <center> <font><font><font>12 to 0.8</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>0.7</font> </font></font></center> |
| <center> <font><font><font>10 to 0.5</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>1.0</font> </font></font></center> |
| <center> <font><font><font>7 to 0.4</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>1.2</font> </font></font></center> |
| <center> <font><font><font>3 to 0.2</font> </font></font></center> | <center> <font><font><font>1.5</font> </font></font></center> |
Prepare sample by adding concentrated DNA loading buffer . DNA always migrates towards the positive electrode. Bromophenol blue (BP) generally co-migrates with 0.5 kb fragments of DNA. Stain with 0.5 mg/ml ethidium bromide for 10 minutes.
Acrylamide Gel for Small DNA Fragment Separations
- Acrylamide is used at a 19:1 ratio with bis-acrylamide, filtered and refrigerated.
- For 40 ml of gel use 25 ml of TEMED and 250 ml of 10% APS solution to polymerize.
- Prepare sample by adding concentrated DNA loading buffer .
- DNA always migrates towards the positive electrode.
-
Stain with 0.5 mg/ml ethidium bromide for 10 minutes.
DNA Size Separation by Acrylamide Percentage<center> <font><font><font><font><font>DNA Size Range<br /> (Base Pairs)</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>Acrylamide<br /> (%)</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>100 - 1,000</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>3.5</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>80 - 500</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>5.0</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>60 - 400</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>8.0</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>40 - 200</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>12.0</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>10 - 100</font> </font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><font>20.0</font> </font></font></font></font></center> DNA Mobility in Acrylamide G els
Migration of marker dyes in bp for native polyacrylamide non-denaturing gels
<center> <font><font><font><font><b><font>Gel %</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>Bromophenol blue (BP)</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>Xylene cyanole (XC)</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>3.5</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>100</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>460 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>5.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>65</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>260 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>8.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>45</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>160 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>12.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>20</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>70 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>20.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>12</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>45 </font> </b></font></font></font></font></center> Migration of marker dyes in bp for polyacrylamide denaturing gels
<center> <font><font><font><font><b><font>Gel %</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>Bromophenol blue (BP)</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>Xylene cyanole (XC)</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>5.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>35</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>130 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>6.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>26</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>106 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>8.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>19</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>75 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>10.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>12</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>55 </font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>20.0</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>8</font> </b></font></font></font></font></center> <center> <font><font><font><font><b><font>28 </font> </b></font></font></font></font></center>
