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农杆菌感受态细胞的制备方法

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农杆菌感受态细胞的制备

1.挑取少许农杆菌LBA4404,接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中,28℃、200r/mim培养过夜。

2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养,直至OD800 为0.5左右。

3.将培养物置冰浴中30min,4℃、5000r/min、离心5min,弃去上清液。

4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl悬浮菌液。

5.4℃、5000r/min,离心5min,弃去上清液。

6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮,分装成50μl/管,液氮中冷冻后至-80℃保存。

农杆菌感受态细胞的制备:

1.试剂配制:solution1 : Rbcl 1.21g 100mM

MgCl2.4H2O 1.02g 50mM

K-Acetate 0.29g 30mM

CaCl2.2H2O 0.15g 10mM

Glycerol 15% 15ml,定容至100ml。

pH=5.8,121度,高压灭菌30min。

solution2: Rbcl 0.12g 10mM

K-Acetate 0.1g 10mM

CaCl2.2H2O 1.1g 75mM

Glycerol 15% 15ml,定容至100ml。

pH=5.8,121度,高压灭菌30min。

2.农杆菌感受态细胞的培养:

15-20ml无抗生素的LB培养基,用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中,28度120转震荡培养过夜。(注意牙签和小三角瓶均需灭菌)

3.制备感受态农杆菌:把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中,室温下,4,000g,离心10min。弃去上清,每管加0.5ml solution1,用手指弹管底部,以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度,4,000g,

离心10min。取出后放在冰上,弃去上清,每管加0.5ml solution2,用手指弹管底部,以使菌体悬浮,冰上放置15mim。分装 感受态农杆菌 ,每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80℃冰箱中保存。

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