农杆菌感受态细胞的制备方法

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农杆菌感受态细胞的制备

1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。

2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为0.5左右。

3.将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。

4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl悬浮菌液。

5.4℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。

6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮，分装成50μl/管，液氮中冷冻后至-80℃保存。

农杆菌感受态细胞的制备：

1.试剂配制：solution1 ： Rbcl 1.21g 100mM

MgCl2.4H2O 1.02g 50mM

K-Acetate 0.29g 30mM

CaCl2.2H2O 0.15g 10mM

Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。

pH=5.8，121度，高压灭菌30min。

solution2： Rbcl 0.12g 10mM

K-Acetate 0.1g 10mM

CaCl2.2H2O 1.1g 75mM

Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。

pH=5.8，121度，高压灭菌30min。

2.农杆菌感受态细胞的培养：

15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。(注意牙签和小三角瓶均需灭菌)

3.制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。弃去上清，每管加0.5ml solution1，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g，

离心10min。取出后放在冰上，弃去上清，每管加0.5ml solution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。分装 感受态农杆菌 ，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80℃冰箱中保存。