真菌菌丝DNA的提取
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由于真菌菌丝体中多糖含量较高,很多方法不易去除干净,不能用于做基因组酶切。
使用如下方法提取菌丝DNA产量高,多糖和蛋白质含量低,符合分子生物学研究要求。
1、取1 g 菌丝体放入冰箱中冻结,然后置于研磨钵中研磨成浆,转入1.5 ml的离心管中;
2、加入0.7 ml提取缓液(0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0;2% CTAB,w/v; 0.02 mol.L-1 EDTA;1.4 mol.L-1 NaCl;2%巯基乙醇,v/v);
3、50℃水浴30 min;
4、加入0.7 ml氯仿-异戊醇混合液(24/1, v/v),振荡均匀形成乳浊液;
5、5 000 r.min-1离心30 min,收集上清液;
6、加入1 ml沉淀缓冲液(0.05 mol.L-1 Tris.HCl, pH 8.0;1% CTAB,w/v;0.01 mol.L-1 EDTA)混合均匀,置室温沉淀30 min;
7、然后在5 000 r.min-1离心15 min,收集沉淀,倒置离心管沥干。将沉淀物悬浮于0.5 ml 1 mol.L-1 NaCl中,并加2倍体积冷冻无水乙醇,置冰箱中沉淀30 min。5 000 r.min-1离心15 min,收集沉淀,用1 ml 70%酒精洗涤并于5 000 r.min-1离心15 min,重复3次,制得DNA沉淀。