抑制消减杂交SSH步骤
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一、cDNA第一链的合成
1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul（10uM） 随机引物（9mer），70℃温浴2min，然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：
| 5×First-strand Buffer | 2ul |
| dNTPs Mix（10mM） | 1ul |
| sterile H2O | 1ul |
| AMV Reverse Transcriptase（20U/ul） | 1ul |
2、42℃反应1.5hr，然后将离心管置于冰上，终止cDNA第一链的合成，然后马上进行第二链的合成。
二、cDNA第二链的合成
1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：
| sterile H2O | 48.4ul |
| 5×Second-strand Buffer | 16.0ul |
| dNTPs Mix（10mM） | 1.6ul |
| 20×Second-strand Enzyme Cocktail | 4.0ul |
2、加入2ul（6U）T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
4、加入100ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出cDNA双链，溶解于50ul双蒸水中。
三、cDNA质量检测
根据一个油菜线粒体基因Ccl1（GI：1694628）的cDNA序列设计特异性引物（CF：5′-TGA CAC GAG ATG ATA AAG A-3′ CR：5′-CGT AAC AAT AGA GCA GGA TAG-3′），目标片段大小为427bp。以反转录所得cDNA为模板，若PCR扩增能得到目标片段，说明线粒体mRNA已经成功反转录。
四、Rsa I酶切双链cDNA
1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：
| ds cDNA | 43.5ul |
| 10×Rsa Restriction Buffer | 5.0ul |
| Rsa I（10U/ul） | 1.5ul |
2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。
3、加入50ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出酶切后的cDNA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。
五、接头连接
酶切消化的tester双链cDNA分为两份，一份与Adaptor1连接，另一份与Adaptor2连接，具体步骤如下：
1、取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释；
2、连接反应液（Ligation Master Mix）的制备如下：
| sterile H2O | 3ul |
| 5×Ligation Buffer | 2ul |
| T4 DNA Ligase | 1ul |
3、在两个EP管中分别加入如下试剂：
| component | Tester1-1 | Tester1-2 |
| diluted tester cDNA | 2ul | 2ul |
| Adaptor1（10Um） | 2ul | / |
| Adaptor2（10Um） | / | 2ul |
| Ligation master mix | 6ul | 6ul |
| Final volume | 10ul | 10ul |
4、在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c；
5、轻微离心，16℃过夜连接；
6、加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix，终止反应；72℃温育5min使ligase失活；
7、取1ul unsubtracted tester control 1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测；
8、所有样品放入-20℃保存。
六、第一次杂交
1、每个杂交反应的体系为：
| component | Hybridzation sample 1 | Hybridzation sample 2 |
| Rsa digested driver cDNA | 1.5ul | 1.5ul |
| Tester1-1（ligated adaptor1） | 1.5ul | / |
| Tester1-2（ligated adaptor2） | / | 1.5ul |
| 4×Hybridzaion Buffer | 1ul | 1ul |
| Final volume | 4ul | 4ul |
2、每个反应管中加一滴矿物油覆盖，短暂离心；
3、98℃ 5min，使DNA充分变性；
4、68℃ 杂交10小时（杂交时间不少于6小时，也不能超过12小时），完成后立即进行第二次杂交。
七、第二次杂交
1、配制第二次杂交混合液
| Driver cDNA | 1ul |
| 4×Hybridzaion Buffer | 1ul |
| sterile water | 2ul |
2、取1ul混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min。
3、将移液器调到15ul，轻轻将枪头伸入Hybridzation sample 2中矿物油与液面交界出，小心将样品吸出，并吸入少许空气；用同样的方法吸入新鲜的变性driver，此时hybridzation sample 2和新鲜变性driver在枪头内由一段气体柱分开，将这一状态的混合物打入装有hybridzation sample 1的离心管中，用枪头混匀，短暂离心。
4、68℃过夜。
5、加入200ul的dilution buffer后68℃ 保温7min。
至此杂交完成，差减杂交完毕后将进行两轮PCR扩增。
八、两次PCR扩增
第一次扩增反应体系为：
| 10×Taq polymerase Buffer | 2ul |
| dNTPs（10uM） | 0.4ul |
| Primer 1（10uM） | 1ul |
| Taq polymerase（2U/ul） | 0.5ul |
| ddH2O | 14.1ul |
| 第二次杂交产物 | 2ul |
| 终体积 | 20ul |
第一次扩增程序为：
| step1 | 75℃ | 5min |
| step2 | 94℃ | 30sec |
| step3 | 66℃ | 30sec |
| step4 | 72℃ | 1.5min |
| step5 | go to step2 | 34 cycles |
| step6 | 72℃ | 5min |
| step7 | 4℃ | hold |
产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。
第二次扩增反应体系为：
| 10×Taq polymerase Buffer | 2ul |
| dNTPs（10uM） | 0.4ul |
| nested primer 1（10uM） | 1ul |
| nested primer 2（10uM） | 1ul |
| Taq polymerase（2U/ul） | 0.5ul |
| ddH2O | 13.1ul |
| 10倍稀释后的第一次PCR产物 | 2ul |
| 终体积 | 20ul |
第二次扩增反应程序为：
| step1 | 94℃ | 30sec |
| step2 | 68℃ | 30sec |
| step3 | 72℃ | 1.5min |
| step4 | go to step1 | 17 cycles |
| step5 | 72℃ | 5min |
| step6 | 4℃ | hold |
反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
