应用案例 | Cell 封面文章发文，揭示无膜细胞器异常导致周围神经病的关键机制

本文作者：崔琴琴浙江大学脑科学与脑医学学院白戈课题组

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth neuropathies，CMT）是一组临床上常见的周围神经遗传病，发病率约为 1/2500。根据致病基因的不同， CMT 可分为几十种不同的亚型。

就 CMT 患者总数而言，在全国范围内是一个非常庞大的数字，然而具体到某些亚型的患者数量却非常稀少，因此 CMT 被收录到国家《第一批罕见病名录》。

 

研究背景

长久以来令人困惑的是，这几十种 CMT 致病蛋白在细胞中的定位和生理功能各异，似乎没有任何明显的共性，然而这些突变蛋白却会导致 CMT 患者表现出非常相似的临床症状。这个被称之为「疾病遗传异质性」的谜团长期以来一直困扰着广大神经科学家和临床工作者。有没有可能不同的致病蛋白最后通过一个「殊途同归」的共同机制引发相似症状？在过去几十年的研究中，领域内逐渐形成了一个共识：大多数神经系统疾病的发生都是遗传因子和环境应激因子共同作用的结果 ^{[1, 2]}。当细胞面临各种不良环境刺激时（如营养缺乏、高温、辐射等），细胞内一个重要的应激机制就是形成应激颗粒（Stress granule，SG），SG 的形成可以避免蛋白的错误翻译，有效地组织利用细胞中各种信号分子和能量资源，使细胞更好地应对环境中的不良刺激，提高细胞存活率 ^{[3, 4]}。近年来越来越多的证据表明，SG 在多种神经退行性疾病中扮演了非常关键的角色，其功能主要是与肌萎缩侧索硬化相关疾病中蛋白沉淀的形成相关 ^[5-7]，而 CMT 是不产生蛋白沉淀的周围神经病，应激颗粒是否参与到 CMT 疾病中尚未有研究 ^[8-10]。     

       

 

研究内容和结果

2023 年 2 月 3 日，浙江大学医学院脑科学与脑医学学院白戈课题组与合作者在 Cell 杂志 ( IF = 66.850 (2022) / JCR 分区: Q1 ) 以封面文章形式在线发表了题为「Diverse CMT2 Neuropathies are Linked to Aberrant G3BP Interactions in Stress Granules「 的研究论文。该工作发现虽然在正常生理状态下不同 CMT 致病蛋白在细胞中的定位各异，但在应激状态下这些 CMT 致病蛋白会表现出相同的细胞定位，进入应激颗粒中并与其核心蛋白 G3BP 发生异常互作，引起应激颗粒异常，使得周围神经应对环境不良刺激的能力下降，从而导致周围神经病的发生。

该研究首先使用浙江大学医学院公用技术平台 Olympus FV3000 激光共聚焦显微镜，在 HeLa 细胞、鸡胚运动神经元和小鼠原代培养运动神经元中确定了导致 CMT2D 亚型的 GlyRS 蛋白能够在应激状态下进入到应激颗粒中（图 1），同时利用该显微镜的时间序列和 FRAP 成像模块获得数据揭示了 GlyRS 致病蛋白对神经元生长长度影响及 GlyRS 致病蛋白对应急颗粒动态性的影响。       

图 1. GlyRS 蛋白在应激下定位到 SG 中。A-C：HeLa 细胞中野生型和突变型的 GlyRS 蛋白在应激状态下进入到 SG 中，并与 SG 核心蛋白 G3BP1 发生共定位。D-F：在鸡胚脊髓运动神经元中验证体内 GlyRS 与 G3BP1 蛋白共定位。G-I：在小鼠原代培养运动神经元中确定了內源性 GlyRS 与 G3BP1 蛋白发生共定位。

随后研究人员通过活细胞荧光成像、邻近标记、定量蛋白质谱、STORM 超分辨成像等技术发现，GlyRS 突变蛋白与 G3BP 的异常相互作用不会影响 SG 组装-解聚的动态变化，却会显著干扰以 G3BP 为核心的 SG 蛋白网络，导致大量非 SG 组分异常滞留在 SG 中，从而扰乱了细胞正常的应激反应，导致运动神经元抵御外界不良环境刺激的能力明显下降，更易发生轴突退变（图 2）。

研 究 人 员 还 进 一 步 鉴 定 出 了 GlyRS 突 变 蛋 白 与 G3BP 的 结 合 位 点 位 于 其 「 内 在 无 序 区 」（Intrinsically disordered region, IDR），通过破坏二者的异常结合，能够消除 GlyRS 突变蛋白对 SG 的干扰，改善运动神经元抵抗不良环境刺激的能力，有效缓解 CMT2D 小鼠模型的疾病症状（图 2）。

图 2. 不同 CMT2 蛋白的共性致病机制

最后，研究人员还发现这个机制可以进一步扩展到其他 CMT2 亚型。通过对 20 几种不同类型 CMT2 致病蛋白进行测试，研究人员发现这些原本定位在细胞内不同部位的蛋白质，在应激条件下大部分都可以进入 SG 并且与 G3BP 发生异常相互作用，引起 SG 异常，导致运动神经元应对环境不良刺激的能力下降。这些发现表明应激颗粒异常很可能是介导不同亚型 CMT 的共性致病机制（图 2）。

 

研究总结与展望

综上，该工作揭示了应激颗粒异常是介导不同亚型 CMT 的共同致病机制，为针对多亚型 CMT 的广谱治疗药物的开发提供了重要理论基础，也为其他疾病遗传异质性的机制研究提供了新的思路。

本研究中多色荧光标记的细胞图像都是采用 Olympus 激光扫描共聚焦 FV3000 拍摄。FV3000 的全真光谱技术可以自由调整标记荧光信号的收集波段，并有效防止不同标记之间的荧光串扰，帮助用户获取更加真实可靠的数据。另外，本文还利用 FV3000 观察了活细胞中的 G3BP1 液滴以及通过 FRAP 实验验证了其相分离特性。FV3000 灵活高效的龙卷风光刺激模式以及追踪运动中的液滴并分析其漂白区域荧光强度变化的功能，是帮助用户进行相分离研究的利器。

 

参考文献

[1]. Saxena, S. and P. Caroni, Selective neuronal vulnerability in neurodegenerative diseases: from stressor thresholds to degeneration. Neuron, 2011. 71(1): p. 35-48.

[2]. Goldman, S.M., Environmental Toxins and Parkinson's Disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2014. 54(1): p. 141-164.

[3]. Protter, D.S.W. and R. Parker, Principles and Properties of Stress Granules. Trends in Cell Biology, 2016. 26(9): p. 668-679.

[4]. Kedersha, N., P. Ivanov and P. Anderson, Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci, 2013. 38(10): p. 494-506.

[5]. Wolozin, B. and P. Ivanov, Stress granules and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci, 2019. 20(11): p. 649-666.

[6]. Li, Y.R., et al., Stress granules as crucibles of ALS pathogenesis. J Cell Biol, 2013. 201(3): p. 361-72.

[7]. Murakami, T., et al., ALS/FTD Mutation-Induced Phase Transition of FUS Liquid Droplets and Reversible Hydrogels into Irreversible Hydrogels Impairs RNP Granule Function. Neuron, 2015. 88(4): p. 678-90.

[8]. Motley, W.W., K. Talbot and K.H. Fischbeck, GARS axonopathy: not every neuron's cup of tRNA. 2010. 33(2): p. 59-66.

[9]. Antonellis, A., et al., Functional analyses of glycyl-tRNA synthetase mutations suggest a key role for tRNA-charging enzymes in peripheral axons. J Neurosci, 2006. 26(41): p. 10397-406.

[10]. Nangle, L.A., et al., Charcot-Marie-Tooth disease-associated mutant tRNA synthetases linked to altered dimer interface and neurite distribution defect. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(27): p. 11239-44.