流式细胞仪检测线粒体膜电位

一、线粒体膜电位检测原理

线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡便不可逆转。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位∆Ψm的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，两者发射光谱不同。在正常细胞内，线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可产生红色荧光；凋亡早期，线粒体膜电位降低，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，可产生绿色荧光。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可检测到细胞膜电位的下降，可将JC-1荧光颜色的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

JC-1单体的最大激发波长为514 nm，最大发射波长为529 nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585 nm，最大发射波长为590 nm。在流式图上表现为FL1和FL2双阳性，而凋亡细胞则大多为FL1单阳性。

二、线粒体膜电位检测实验操作指南

1．根据实验需求配制1× JC-1 Assay Buffer 和JC-1染色工作液，详见产品使用说明。稀释好的1× JC- 1 Assay Buffer保存在4°C。

2．阳性对照设置，详见产品使用说明；细胞按照实验方案进行凋亡诱导。

3．诱导完成后的细胞，300 g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS轻轻重悬细胞并计数。

注：良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于凋亡检测时，可能会因为胰酶消化、吹打等处理导致细胞的坏死或凋亡，对实验结果可能存在不可控的影响，请谨慎处理。

4．取1-5 × 10⁵重悬的细胞，300 g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清。

5．细胞悬液中加入500 μL JC-1染色工作液重悬细胞。37°C，5%CO₂培养箱中孵育15-20 min。

注：培养温度与细胞类型有关，一般哺乳动物细胞建议37°C，其他种属根据细胞培养条件选择合适的温度。

6．300 g离心5 min，弃上清，加入500 μL预冷的1x JC-1 Assay Buffer洗涤2次。

7．加入500 μL预冷的1x JC-1 Assay Buffer重悬细胞。

8．样本置于冰上保存，30 min内用流式细胞仪检测。

三、显微镜或流式细胞仪检测

A、荧光显微镜观察

1．滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；

2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；用PBS洗涤细胞两次；

滴加100μL 1x JC-1染色工作液，加盖玻片，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育15~20min；1× JC- 1 Assay Buffer洗涤1~2遍；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察。
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；

检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。
如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置。
检测JC-1聚合物可参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶的设置。

出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

B、流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况。

绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。

正常细胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化。

实验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和经CCCP处理的阳性对照组，根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置。