教您正确选择逆转录酶，适用 6 种不同应用

逆转录反应，作为分子生物学研究的基本技术之一，已经广泛应用到多个研究领域，可以说是科研人员进行 RNA 功能研究的看家本事。

众所周知，逆转录的应用领域有以下 6 种：

• 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 定量RT-PCR（RT-qPCR）
• cDNA 克隆和文库构建
• cDNA 末端快速扩增（RACE）
• 基因表达芯片
• RNA 测序（RNA-Seq）

今天，小编就整理了一些贴士，帮助大家在面对 6 种不同的应用时，如何正确选择逆转录酶。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

在 RT-PCR 中，逆转录酶将 RNA 转化为 cDNA，然后通过 PCR 反应扩增 cDNA，为下游实验提供研究模板，因而逆转录酶是实验成功的关键步骤之一（如下图）。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率，即便是难转录 RNA 样本，如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的 RNA 样本。

图. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT =逆转录，RTase =逆转录酶

常用的 RT-PCR 方法分为一步法和两步法，每种方法都各有优缺点，简要概述如下：

表. 对比一步法和两步法 RT-PCR

定量 RT-PCR（RT-qPCR）

定量 RT-PCR（RT-qPCR）的最常见应用之一是通过对细胞和组织一段时间或事件后（如，药物治疗）实时 mRNA 水平的定量分析。RT-qPCR 比 RT-PCR 的灵敏度更高， RT-qPCR 基因表达定量的准确性在很大程度上取决于 cDNA 模板的质量和数量。因此，逆转录对于 RT-qPCR 的成功至关重要。所选择的逆转录酶应该具有以下特点：

• 高效合成 cDNA 的能力，即使是对低丰度基因以及次优质和/或难转录 RNA 样本。
• 在宽的 RNA 起始量范围内，cDNA 的动态范围或线性度最佳，可确保基因表达定量的准确性。
• 所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的 cDNA 得率，以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。可考虑预混液形式的逆转录酶用以可以减少实验误差。

RT-qPCR 的一个特殊程序是从未经 RNA 分离的粗细胞裂解物直接进行逆转录。在使用稀缺样本或选用群体内特定细胞的实验，可考虑使用直接 RT-qPCR 法来防止可能的样本损失和低 RNA 回收。

cDNA 克隆和文库构建

cDNA 文库可由代表特定样本中转录序列的 cDNA 克隆组成。因此，文库提供了关于特定细胞类型、器官或发育阶段的基因时空表达信息。cDNA 文库克隆可用于鉴定新型 RNA 转录物、测定基因序列和重组蛋白的表达。

构建 cDNA 文库的必要条件是 RNA 可适当代表其全长和/或相对丰度，因此，逆转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的逆转录酶可以合成长 cDNA，并捕获低丰度 RNA。同样，在对具有高度二级结构的 RNA 进行逆转录时，建议使用热稳定性较强的逆转录酶。

cDNA 末端快速扩增（RACE）

cDNA 末端快速扩增（RACE）是一种基于 PCR 的方法，可用于确定 cDNA 5'和3'末端的未知序列。通常，这些方法分别被称为 5' RACE和 3' RACE。

在 5'RACE中，任何长度的（甚至包括未到达mRNA 5'末端的）第一链 cDNA 都将具有添加序列（即同聚物尾部结构或接头），随后通过 PCR 进行扩增。为了最大化全长 cDNA 的合成，应选择具有最小 RNA 酶 H 活性、高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。

在 3'RACE 中，全长 cDNA 并不重要，因为不会扩增 PCR 起始位点的上游序列。但是，最好选用可生成长 cDNA 的逆转录酶，因为没有到达 PCR 引物结合位点的cDNA不会出现在 RACE 分析中。

基因表达芯片

在选择逆转录酶以制备用于基因芯片实验的 cDNA 靶标时，获得高产量全长 cDNA 的能力对于良好覆盖 RNA 来说至关重要，包括富含 GC 或具有二级结构的 RNA 序列。同样重要的是，为确保获得高信噪比，逆转录酶必须能够有效整合修饰的核苷酸，从而能够准确且无偏差地检测输起始 RNA。

RNA测序（RNA-Seq）

随着二代测序（NGS）的出现，RNA-Seq 已经成为用于分析全转录组（即转录的编码和长非编码 RNA）、测定基因表达、发现剪接变异和融合转录物以及检测低丰度基因的的高通量方法。与基因芯片相比，RNA-Seq 的优点包括动态范围更大、灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征 RNA 序列。

逆转录酶的保真度可能在 RNA 测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。逆转录酶的保真度指的是 RNA 逆转录为 DNA 过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道，基于 MMLV 的逆转录酶错误率在合成 15,000 到 27,000 个核苷酸中有一个错误核苷酸，而 AMV 逆转录酶表现出更高的错误率。

逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶（TdT）活性， 对于 RNA 测序（RNA-Seq），TdT 活性可以诱导逆转录酶特异性地向 cDNA3′ 末端加入一系列 Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的 cDNA 合成期间及合成后阶段，这种类型的 TdT 活性会被触发。结合特殊设计的具有 3’Gs（称为模板切换寡核苷酸）的 DNA 寡核苷酸，TdT 活性可以特异性地修饰 3’cDNA 末端和 5′ RNA 末端。这些序列修饰的实例包括引入用于随后 cDNA 合成步骤的限制性位点和/或用于下游 RNA 测序步骤的接头添加。

文章来源：赛默飞世尔科技