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教您正确选择逆转录酶,适用 6 种不同应用

赛默飞世尔科技

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逆转录反应,作为分子生物学研究的基本技术之一,已经广泛应用到多个研究领域,可以说是科研人员进行 RNA 功能研究的看家本事。

众所周知,逆转录的应用领域有以下 6 种:

  • 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
  • 定量RT-PCR(RT-qPCR)
  • cDNA 克隆和文库构建
  • cDNA 末端快速扩增(RACE)
  • 基因表达芯片
  • RNA 测序(RNA-Seq)

今天,小编就整理了一些贴士,帮助大家在面对 6 种不同的应用时,如何正确选择逆转录酶。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

在 RT-PCR 中,逆转录酶将 RNA 转化为 cDNA,然后通过 PCR 反应扩增 cDNA,为下游实验提供研究模板,因而逆转录酶是实验成功的关键步骤之一(如下图)。选定的逆转录酶应对所有样本均具有最高效率,即便是难转录 RNA 样本,如降解、抑制剂残留或具有高度二级结构的 RNA 样本。

图. 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT =逆转录,RTase =逆转录酶

常用的 RT-PCR 方法分为一步法和两步法,每种方法都各有优缺点,简要概述如下:

表. 对比一步法和两步法 RT-PCR

定量 RT-PCR(RT-qPCR)

定量 RT-PCR(RT-qPCR)的最常见应用之一是通过对细胞和组织一段时间或事件后(如,药物治疗)实时 mRNA 水平的定量分析。RT-qPCR 比 RT-PCR 的灵敏度更高, RT-qPCR 基因表达定量的准确性在很大程度上取决于 cDNA 模板的质量和数量。因此,逆转录对于 RT-qPCR 的成功至关重要。所选择的逆转录酶应该具有以下特点:

  • 高效合成 cDNA 的能力,即使是对低丰度基因以及次优质和/或难转录 RNA 样本。
  • 在宽的 RNA 起始量范围内,cDNA 的动态范围或线性度最佳,可确保基因表达定量的准确性。
  • 所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的 cDNA 得率,以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。可考虑预混液形式的逆转录酶用以可以减少实验误差。

RT-qPCR 的一个特殊程序是从未经 RNA 分离的粗细胞裂解物直接进行逆转录。在使用稀缺样本或选用群体内特定细胞的实验,可考虑使用直接 RT-qPCR 法来防止可能的样本损失和低 RNA 回收。

cDNA 克隆和文库构建

cDNA 文库可由代表特定样本中转录序列的 cDNA 克隆组成。因此,文库提供了关于特定细胞类型、器官或发育阶段的基因时空表达信息。cDNA 文库克隆可用于鉴定新型 RNA 转录物、测定基因序列和重组蛋白的表达。

构建 cDNA 文库的必要条件是 RNA 可适当代表其全长和/或相对丰度,因此,逆转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的逆转录酶可以合成长 cDNA,并捕获低丰度 RNA。同样,在对具有高度二级结构的 RNA 进行逆转录时,建议使用热稳定性较强的逆转录酶。

cDNA 末端快速扩增(RACE)

cDNA 末端快速扩增(RACE)是一种基于 PCR 的方法,可用于确定 cDNA 5'和3'末端的未知序列。通常,这些方法分别被称为 5' RACE和 3' RACE。

在 5'RACE中,任何长度的(甚至包括未到达mRNA 5'末端的)第一链 cDNA 都将具有添加序列(即同聚物尾部结构或接头),随后通过 PCR 进行扩增。为了最大化全长 cDNA 的合成,应选择具有最小 RNA 酶 H 活性、高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。

在 3'RACE 中,全长 cDNA 并不重要,因为不会扩增 PCR 起始位点的上游序列。但是,最好选用可生成长 cDNA 的逆转录酶,因为没有到达 PCR 引物结合位点的cDNA不会出现在 RACE 分析中。

基因表达芯片

在选择逆转录酶以制备用于基因芯片实验的 cDNA 靶标时,获得高产量全长 cDNA 的能力对于良好覆盖 RNA 来说至关重要,包括富含 GC 或具有二级结构的 RNA 序列。同样重要的是,为确保获得高信噪比,逆转录酶必须能够有效整合修饰的核苷酸,从而能够准确且无偏差地检测输起始 RNA。

RNA测序(RNA-Seq)

随着二代测序(NGS)的出现,RNA-Seq 已经成为用于分析全转录组(即转录的编码和长非编码 RNA)、测定基因表达、发现剪接变异和融合转录物以及检测低丰度基因的的高通量方法。与基因芯片相比,RNA-Seq 的优点包括动态范围更大、灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征 RNA 序列。

逆转录酶的保真度可能在 RNA 测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。逆转录酶的保真度指的是 RNA 逆转录为 DNA 过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道,基于 MMLV 的逆转录酶错误率在合成 15,000 到 27,000 个核苷酸中有一个错误核苷酸,而 AMV 逆转录酶表现出更高的错误率。

逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(TdT)活性, 对于 RNA 测序(RNA-Seq),TdT 活性可以诱导逆转录酶特异性地向 cDNA3′ 末端加入一系列 Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的 cDNA 合成期间及合成后阶段,这种类型的 TdT 活性会被触发。结合特殊设计的具有 3’Gs(称为模板切换寡核苷酸)的 DNA 寡核苷酸,TdT 活性可以特异性地修饰 3’cDNA 末端和 5′ RNA 末端。这些序列修饰的实例包括引入用于随后 cDNA 合成步骤的限制性位点和/或用于下游 RNA 测序步骤的接头添加。

文章来源:赛默飞世尔科技

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