为什么我的标准曲线长这样？

做过 qPCR 实验的小伙伴都知道，稳定和精确的 qPCR 实验常和 PCR 的扩增效率有关。实验中，为了确保 qPCR 实验结果的准确，建议在实验前通过标准曲线的实验评估 PCR 的扩增效率。做标准曲线实验的时候，建议将标准品进行至少 5 个数量级的梯度稀释，每个梯度稀释液进行 3 次重复，然后将稀释的标准品进行 qPCR 实验，最后根据各样品的浓度（或未知浓度样品的稀释倍数）及相应的 Ct 值绘制标准曲线（图 1）。

图 1. 扩增曲线和标准曲线

其中，slope 是标准曲线的斜率，Eff% 是扩增效率，Eff%= 10(-1/slope)-1，一般建议扩增效率在 90%-110% 之间。R2 是用来衡量拟合曲线和单个数据点之间相关性的参数，一般建议在 0.99 以上。

然而，看似简单的实验，做起来却会遇到各种各样的情况，经常有客户咨询标准曲线实验相关的问题。今天，小编就通过几个案例来给大家介绍一下标准曲线结果异常的几个常见原因，内容涉及实验操作和软件设置，希望能对大家的实验有所帮助。

案例 1：标准曲线的趋势不对

在这个案例中，低浓度的标准品稀释液对应的 Ct 值比较小，而高浓度的标准品稀释液对应的 Ct 值却比较大（图 2A），Ct 值和浓度是正相关，对应的扩增效率是-49.233%。我们知道，根据 qPCR 的原理，Ct 值和浓度是负相关，对应的扩增效率为正值（图 2B）。因此，我们推测在这个案例中，软件设置的标准品浓度和实际的浓度不一致。

图 2. 异常的标准曲线和正常的标准曲线

结合 Amplification Plot 扩增图谱中的曲线，我们发现标准品的实际加样顺序是低浓度到高浓度（浓度顺序: 1, 10, 100, 1000, 10000），而软件设置的加样顺序是高浓度到低浓度（浓度顺序: 10000, 1000, 100, 10, 1）（图 3）。找到原因后，我们将结果切换到 Plate 设置界面，按照实际加样浓度设置标准品，然后回到 Results 界面，点击 Analyze 重新分析以后，标准曲线就正常了。

图 3. 结合扩增曲线发现，标准品的加样浓度和软件设置的不一致

案例 2：标准曲线不显示

在这个案例中，客户在同一块 96 孔板上检测 2 个 assay（18S-1，18S-2）的扩增效率，18S-1 这个 assay 的标准曲线正常显示，而 18S-2 的标准曲线却不显示（图 4）。查看 18S-2 这个 assay 所在孔位的扩增情况，扩增曲线正常（图 5）。因此，排除实验操作环节的问题，推测是设置标准曲线的时候出了问题。

图 4. 标准曲线不显示

图 5. 扩增曲线正常

回到 Setup 设置界面，我们发现 18S-2 对应的标准品反应类型是 U（Unknown），并不是 S（Standard），因此软件没法绘制标准曲线。随后，我们将 18S-2 标准品的反应类型修改为 S，并正确输入对应的浓度（图 6A），然后在 Results 界面点击 Analyze 重分析，看到 18S-2 的标准曲线正常显示了（图 6B）。

图 6. 修改标准品反应类型后，标准曲线正常显示

案例 3：个别稀释点偏离标准曲线

在这个案例中，扩增效率正常显示，但是有两个稀释点偏离标准曲线（图 7A）。首先，我们将结果切换到 Amplification Plot 扩增图谱中，发现 5 个标准品稀释液的扩增曲线是正常的（图 7B），说明标准品的稀释没有问题，可能是加样顺序和软件设置顺序不一致导致的问题。

图 7. 两个稀释点偏离标准曲线

接下来，进一步观察两个异常点的 Ct 值和对应的浓度，发现低浓度稀释点对应 Ct 值小，而高浓度稀释点对应的 Ct 值大，推测是加样过程中这两个标准品稀释液加反了。随后，我们在 Setup 设置界面修改布板信息，将异常的两个稀释点的标准品的浓度进行修改（图 8A），然后在 Results 界面点击 Analyze 重分析后，看到所有稀释点都在标准曲线上（图 8B）。

图 8. 正确设置标准品浓度，标准曲线正常

通过上面三个案例的介绍，我们可以发现，加样顺序或者软件布板设置错误会导致标准曲线异常。因此，建议大家在平时的实验中，一定要根据实际的加样顺序在软件中正确设置，从而提高实验效率。不过，即使确实由于粗心搞错了，也不用着急，ABI 的仪器在数据收集结束以后是支持重分析的。我们只需在拿到结果文件以后，按照上述案例的思路分析，将错误的设置进行更改并重分析后可以得到正确的结果，无需重新再做实验。

案例 4：部分稀释点偏离标准曲线

在这个案例中， 7 个梯度的标准品稀释液，每个稀释液做 3 个重复，发现部分稀释点偏离标准曲线，且 R2 为 0.967，扩增效率只有 79.506%（图 9A）。首先，我们将结果切换到 Amplification Plot 扩增图谱（图 9B），发现标准品稀释液的曲线之间并不是等距离分布，说明标准品稀释不准确。我们知道，在扩增效率为 100% 的时候，PCR 产物理论上是按照 2n 进行扩增。如果标准品按照 10 倍梯度稀释，那么相邻的两个标准品稀释液的 Ct 值应该相差 3.32（23.32 = 10）。而这个案例中，我们看到不同标准品稀释液之间的距离相差很大，推测是样本稀释环节出问题，建议核查一下实验环节，重新稀释标准品并进行实验。

图 9. 部分稀释点偏离标准曲线

标准曲线实验中，标准品需要按照连续梯度的方法进行稀释。准备好的稀释液需要充分振荡并离心，然后再准备下一个梯度的稀释液。此外，容易被大家忽略的是移液枪的准确性，建议大家定期校准移液枪，确保结果的准确性。

案例 5：所有稀释点都偏离标准曲线

在这个案例中，5 个标准品稀释点均不在曲线上，扩增效率为 2142.868%（图 10A）。首先，我们将结果切换到 Amplification Plot 扩增图谱（图 10B），发现只显示 4 个标准品稀释液的扩增曲线，说明加样环节出现问题。进一步观察发现，黄色和浅绿色的扩增曲线重叠（软件设置的对应浓度：1，0.1），而次高浓度稀释液对应的区域缺少扩增曲线，说明操作的时候错误将最高浓度的标准品稀释液加入到次高浓度的标准品稀释液中。

图 10. 所有稀释点都不在标准曲线上，且扩增曲线异常（数字为软件设置的标准品浓度）

如果只是错加两个标准品稀释液，那么其他稀释点应该在直线上，而这个结果中所有的点均不在曲线上。进一步分析每个稀释点的扩增曲线发现，实际的加样浓度（0.001, 10, 10, 0.01, 0.1）和软件设置的浓度（10, 1, 0.1, 0.01, 0.001）不一致（图 11A），这也是所有点均不在标准曲线上的原因。根据加样顺序正确设置浓度后，在 Results 界面点击 Analyze 重分析，标准曲线正常显示（图 11B）。虽然标准曲线和参数均正常显示，但是鉴于错误将最高浓度的标准品加入到次高浓度的标准品中，且个别点偏离拟合的标准曲线，所以建议重新实验。

图 11. 正确设置加样浓度后，标准曲线正常显示

在这个案例中，实验操作和软件设置均出错，导致标准曲线异常。这种情况下，我们需要结合标准曲线实验的基本原理和扩增曲线图谱进行排查，找到问题的原因，并在后续的实验中进行改进。

案例 6：浓度较低标准品稀释液的 Ct 值异常

在这个案例中， 7 个梯度的标准品稀释液，每个稀释液做 2 个重复，实验结束后发现，浓度较高的四个点（对应 A3-D4 孔，浓度分别为 20000, 2000, 200, 20）的 Ct 值和浓度是负相关，符合标准曲线的趋势。但是剩余的 3 个梯度的标准品稀释液对应（E3-G4 孔，浓度分别是 2, 0.2, 0.02）的 Ct 值却相差不大，接近浓度 20 这个稀释液（红色圈）对应的 Ct 值（图 12）。

图 12. 低浓度标准品稀释液的 Ct 值异常

由于实验采用的是 SYBR 试剂，推测低浓度标准品稀释液体系中可能存在非特异性片段的扩增，查看溶解曲线发现所有孔的溶解曲线一致，排除非特异性扩增的可能（图 13A）。

图 13. 标准品特异扩增，而低浓度标准品曲线和阴性对照曲线几乎重合

根据 qPCR 的实验原理，如果 Ct 值比较相近，那么说明样本中的模板浓度是比较接近的，也就是说 D3-G4 这些反应孔中的模板量是比较接近的。随后，将结果切换到 Amplification Plot 扩增图谱，我们发现 D3-G4 这些反应孔对应的扩增曲线和阴性对照（H3-H4 孔，玫红色曲线）的曲线几乎重合（图 13B），说明这些反应中的模板量是接近的。后续跟操作人员沟通实验细节，确认操作人员并没有错误地将 20 这个浓度的标准品稀释液加入到后面 3 个低浓度和阴性对照的反应孔中，因而排除了操作环节的问题。进一步推测，怀疑操作过程中可能存在污染，而这个污染源的模板量和 20 这个浓度的标准品稀释液的模板接近。随后排查发现，该实验室近期进行过相关靶标的检测，极有可能造成了污染。对于后续的实验，建议对操作区域进行污染源的清除，并重新做实验。

通过后面三个案例的介绍，我们可以发现，如果标准品稀释和加样环节出错，或者由于污染而导致的实验结果异常是不能通过后期的重新分析进行挽救的。因此，我们建议大家在平时的实验中，正确操作，减少污染的发生，从而提高实验效率。

我们可以通过这些案例发现，一个成功的标准曲线实验离不开规范的实验操作和正确的软件设置。如果您在后续实验中遇到类似案例，可以借用上述的分析思路进行排查。当然，大家在实验中碰到的异常结果绝不仅限于这些案例中的情况，如果您碰到无法解决的案例，欢迎联系赛默飞的技术支持，我们将尽力给您提供帮助。