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原位聚合酶链式反应(in situ PCR)和原位反转录聚合酶链式反应(in situ RT-PCR)操作规程

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1189
(一)、仪器设备
英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。

(二)、操作流程
1 、原位 PCR 步骤
1 )预处理:
1 )切片常规脱蜡;
2 0.2mol/L HCl 处理 10min
3 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化组织 37 10min
4 Nase 消化组织 37 30min
5 )梯度酒精脱水,室温干燥。
2 )原位扩增:
1 )切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
2 PCR 热循环: 94 ℃, 1min 55 ℃, 1min 72 ℃, 1.5min ,共 25 30 个循环, 72 ℃延伸 10min
3 )氯仿洗去盖玻片, 4 %多聚甲醛后固定 10min ,梯度酒精脱水,干燥。
3) 原位杂交:
1 )加地高辛标记探针的杂交液, 98 ℃变性 10min -20 ℃退火 5min 42 ℃杂交过夜。
2 )杂交后用 2×SSC 洗涤 10min 3 次, 1×SSC 洗涤 10min 3 次;
3 )缓冲液洗涤 10min 3 次;
4 )加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物, 37 ℃, 2h
5 )缓冲液洗涤 5min 3 次;
6 NBT BCIP 暗处显色,镜下控制,终止显色。
7 )常规脱水:透明、封固。
2 、原位 RT-PCR 步骤
1 )预处理:
1 )蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ,蒸馏水洗;
2 95 ℃加热 3min ,灭活残存的蛋白酶。
2 )原位扩增:
1 )在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
2 )用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75 ℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至 95 ℃, 2min 。再将热循环仪设定为 95 ℃, 45s 55 ℃, 1min 75 ℃, 45s ,共 26 次循环;
3 )扩增结束后,在 80 ℃烤 15min 30min
3 )原位杂交:
1 )杂交前标本 95 ℃加热 3min
2 )加上杂交液,湿盒内 50 ℃过夜; 杂交液组成: 25 %硫酸葡聚糖, 2×SSC 50 %甲酰胺, 0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA 0 5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng
3 )扩增的β - 肌动蛋白和 IL-6 DAKO 检测试剂盒 K600( 链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝 ) 检测。阳性反应呈紫色。

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