牛肉膏蛋白胨培养基的制备

 

实验十九 牛肉膏蛋白胨培养基的制备

 

　　一、目的要求

　　1．明确培养基的配制原理。

　　2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

　　二、基本原理

　　牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

　　由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

　　牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：

　　牛肉膏 3g

　　蛋白胨 10g

　　NaCl 5g

　　琼脂 15—20g

　　水 1000ml

　　pH 7．4—7．6

　　三、器材

　　牛肉膏，蛋白胨， NaCl，琼脂；

　　1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；

　　试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（ pH 5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

　　四、操作步骤

　　1．称量

　　按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

　　2．溶化

　　在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。

　　3．调pH

　　在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

　　对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。

　　4．过滤

　　趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。

　　5．分装

　　按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。

　　分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。

　　(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

　　(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

　　(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

　　6．加塞

　　培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。

　　7．包扎

　　加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

　　8．灭菌

　　将上述培养基以1．05kg/cm² （15磅/英寸² ），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

　　9．搁置斜面

　　将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

　　10．无菌检查

　　将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

　　附：棉塞的制作

　　棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状、大小、松紧与试管口（或三角烧瓶口）完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内，如图Ⅴ-3。棉塞的制作过程如图Ⅴ-4。

 

　　此外，在微生物实验和科研中，常要用通气塞。所谓通气塞，就是几层纱布（一般为8层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好通气促使菌体的生长或发酵。通气塞的形状如图Ⅴ-5。

　　五、实验报告

　　思考题

　　（1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？

　　（2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？图Ⅴ—5通气塞A．配制时纱布塞法；B．灭菌时包牛皮纸；C．培养时纱布翻出

　　（3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？