实验42 乙醇酸氧化酶活性测定（比色法）

实验42 乙醇酸氧化酶活性测定（比色法）

原理

　　乙醇酸氧化酶在光呼吸作用中起重要的作用，在它的作用下将乙醇酸氧化生成乙醛酸和过氧化氢，反应如下：

　　如果我们以二氯靛酚作为氢受体，接受乙醇酸氧化时脱下的H ，使二氯靛酚还原，此时原来为蓝色的染料则褪至无色，其反应如下：

　　利用染料颜色的变化，即可对酶的活性进行比色测定。由于在酶的粗制品中还含有靛酚氧化酶，它能使二氯靛酚氧化，影响比色测定。KCN能抑制靛酚氧化酶，而对乙醇酸氧化酶没有作用，KCN用量需预先试验确定之。

仪器药品

　　721型分光光度计　　　　　离心机

　　磁力搅拌器 　　　　　　　台天平

　　研钵　　　　　　　　　　 试管架

　　移液管 　　　　　　　　　漏斗

　　烧杯 　　　　　　　　　　试管

　　纱布 　　　　　　　　　 10%醋酸

　　硫酸铵 0.1% 2，6—　　二氯靛酚

　　0.1mol/L磷酸钾缓冲液，pH8.0（见附表2）

　　0.02mol/L磷酸钾缓冲液，pH8.0：先配0.02mol/L K2HPO4，然后用0.02mol/L KH2PO4调至pH8.0。

　　0.04mol/L乙醇酸钾：称取304mg乙醇酸用氢氧化钾中和，最后用蒸馏水定容至100ml。

　　0.01mol/L KCN：称取65mg KCN溶于100ml 0.01mol/L NH4OH中（注意：KCN有剧毒！）。

操作步骤

　　1．酶粗制品的制备

　　新鲜菠菜叶或烟草叶，自来水洗净，用吸水纸吸干，称取30g，加30─60ml蒸馏水，在0─5℃下研磨，经4层纱布过滤，滤液用1000r/min离心15分钟，弃去沉淀。然后用10%醋酸调节pH至5.4，用3500─4000r/min离心15分钟，除去蛋白质沉淀。于上清液中加硫酸铵，使达到20%饱和度（见附表8），在磁力搅拌器上边加边不停地搅动30分钟，离心除去沉淀，于上清液中再加入硫酸铵，使达到30%饱和度，离心20分钟，沉淀即为酶的粗制品。用少量0.02mol/L磷酸钾缓冲液（pH8.0）溶解，使其体积为开始时提取液体积的1/10，保存于冰箱中，待测。

　　2．酶活性测定

　　取一试管加入0.6─0.8ml 0.01mol/L KCN、0.5ml 0.04mol/L乙醇酸钾、0.5ml稀释5─10倍的酶液，加0.1mol/L磷酸钾缓冲液使体积达3.7ml，最后加入0.3ml二氯靛酚染料，使其总体积为4ml，迅速混匀倒入光径为1cm的比色杯中，于620nm读取吸光度。另取比色杯不加染料以缓冲液代之，作为空白调零用。

　　加入染料1分钟后开始读数，每隔30秒钟读数一次，大约在3—4分钟内吸光度A620成直线下降。

　　3．计算

　　以每分钟使A620下降0.01所需的酶量定为1酶活性单位，也可以用每分钟使A620下降0.01所需的材料鲜重表示酶的活性。此方法可以分析酶活力为1—15单位。