实验62 脱落酸（ABA）放射免疫测定

实验62 脱落酸（ABA）放射免疫测定

原理

　　ABA放射免疫测定(radioimmunoassay, RIA)是一种分子相同的标记ABA~undefinedAg)和非标记ABA(Ag)与另一种浓度有限的专一性抗ABA抗体(Ab)进行的竞争性抑制反应：

　　当反应体系中Ag和Ab量保持恒定，并且Ag量>Ab量(Ag~Kb~M~I~K~Hb~M_Ab100~Kb~M~I~K~Hb~M_35~B时，加入的Ag量越多，则Ag被稀释的程度也就越大，使结合的Ag·Ab~AB~B（B为bound，表示结合状态）量随之减少，（即Ag·Ab量增加），游离的Ag（F）（F为free，表示游离状态）量增多。因此，B/B F或B/T（T为total，即T=B F）或B/F与Ag量存在着一种函数关系。抗原抗体反应平衡后，用饱和硫酸铵溶液分离游离和结合状态的标记ABA，在液体闪烁器上测定游离标记ABA的放射性。如以一系列已知浓度的ABA对B/T或B/F作图制成标准曲线，就可根据样品管的放射性强度从标准曲线上查出未知样品中的ABA含量。

　　用ABA—C₁ OOH和牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)的结合物制备的抗ABA抗体，对结合态ABA(^C ABA,C表示羧基)的亲和力稍大于游离态ABA(^F ABA)的亲和力。植物样液里的叶绿素和胡萝卜素等亲脂色素是一类干扰液体闪烁计数的有色淬灭物质。对样液进行萃取分离，可以很方便地将有色淬灭物质除去，将样液分离为^F ABA液和^C ABA液（回收率94梍96%。从而用本法准确测出样品的C^ABA 和F^ABA 含量。

仪器药品

　　1．仪器设备

　　低温高速离心机 　　　　　普通离心机

　　涡旋混合器 　　　　　　　微型研钵

　　尖底离心管 　　　　　　　试管架

　　微量加液器 　　　　　　　微量进样器

　　2．ABA RIA药盒（南京农业大学产品）

　　(1)磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline,PBS,干粉)，2瓶。每瓶干粉先用5ml热的蒸馏水溶解，再定容到50ml，即为含有0.1%NaN³ 和0.1%明胶的pH7.4的0.01mol/L的PBS液。4℃贮放备用。

　　(2)2—cis（ ）³ H—ABA液（干粉），3瓶（0.2μCi/瓶）。每瓶干粉加3.5ml PBS液溶解，每50μl含有7000─9000cpm（计数率62%）。避光，－20℃保存备用。

　　(3)2─cis（ ）ABA标准液（干粉），5瓶。每瓶加1ml PBS液溶解，每50μl分别含有300、600、1200、2400、4800pg ABA。避光，－20℃保存备用。

　　(4)兔抗2─cis（±）ABA抗体（干粉），1瓶。用19ml PBS溶解，分装3─4个小瓶，置－20℃保存备用。

　　(5)0.5%BSA温育液，1瓶。用10ml PBS溶解BSA干粉，4℃保存备用。

　　(6)饱和硫酸铵分离液（saturated ammonium sulfate, SAS），1瓶。在50ml热蒸馏水中深入硫酸铵，4℃保存，待粗大晶块出现后使用。

　　3．自备药品

　　(1)闪烁液：取萘60g,1,4－双[2′（5′－苯基噁唑）]苯（POP—OP）40mg，2，5二苯基噁唑（PPO）4g，溶入1000ml二氧六环中，避光保存备用。

　　(2)0.01mol/L H₃ PO₄ 液，pH2.5。

　　(3)0.01mol/L Na₂ HPO₄ 液，Ph9.2。

　　(4)80%甲醇。

　　(5)乙酸乙酯。

　　(6)无水酒精。

操作步骤

　　1．提取样液

　　准确称取50─100mg鲜重的植物试样，立即置于在冰浴中预冷的研钵中，加1ml80%甲醇（4℃）和少许石英砂，在弱光下仔细研磨成匀浆。将上清液收入离心管，残渣再用同法重复研磨提取2次，合并提取液，3000g（4℃）离心10分钟，吸出上清液，贮－20℃备用。

　　2．样液中^c ABA和^F ABA及有色淬灭物质的萃取分离

　　(1)^c ABA、^F ABA及有色淬灭物质的分离：取100μl样液置萃取用尖底试管（A管）中，氮气吹干，随即加入100μl pH2.5的0.01mol/L的磷酸液洗脱，涡旋混合2分钟，再加入100μl乙酸乙酯液进行萃取，涡旋混合2分钟；静置分层后，^c ABA溶于下层磷酸液中，有色淬灭物质和^F ABA则溶于上层乙酸乙酯液中（回收率均96%）。

　　(2)^F ABA和有色淬灭物质的萃取分离：吸出50μl含^F ABA和有色淬灭物质的乙酸乙酯液置另1尖底试管（B管）中，加入100μl pH9.2的0.01mol/L的碱性磷酸盐液进行萃取，涡旋混合2分钟后静置分层，此时有色淬灭物质仍在上层乙酸乙酯相里，^F ABA则溶于下层碱性磷酸盐液中（回收率90%）。完成以上萃取分离步骤后，磷酸液中^c ABA和碱性磷酸液中^F ABA的含量即可用RIA测出。

　　3．ABA的放射免疫测定

　　所有样液的转移，操作皆在弱光下进行，温育过程在4℃黑暗中进行。平行三管或双管进行标准曲线和样液ABA含量的测定。

　　本底管（N）、总计数管（T）和零标准管（B₀ ）分别加入200μl、150μl和50μl PBS液，各标准管（B）由稀至浓地加入50μl不同ABA浓度的标准液，样品管（S）加50μl含^F ABA的碱性磷酸盐液或^c ABA的磷酸液。接着在B₀ 管、B管和S管中加入100μl抗体稀释液，涡旋混匀，4℃反应1小时。然后用微量进样器分别在T管、B₀ 管、B管和S管中准确加入50μl³ H—ABA液，混匀，4℃反应1小时。然后于各管中加入0.5%BSA50μl，混匀后加入饱和硫酸铵（SAS）分离液250μl，立即混匀，4℃1小时。最后，用普通离心机3000r/min离心20分钟，准确吸出400μl上清液至洁净闪烁瓶内，加5ml闪烁液，加盖密闭，混匀，用无水酒精清洗闪烁瓶外壁，暗处存放1小时后用液体闪烁计数器测出上清液的放射性强度（^F cpm值）。表1为ABA放射免疫测定时的加样顺序。

　　4．计算

　　各测定值减去本底值后算出cpm的值。总计数管中未加抗体，测得cpm为管内³ H—ABA脉冲数总值（T）。其余各管测得cpm的值为F。T—F=Bcpm值，为沉淀物中给抗体结合了³ H—ABA的脉冲数。零标准管内没有非标记ABA，T—F=B₀ cpm为抗体和³ H—ABA的最高结合值。各标准管计算B/F或B%（B/T×100%）或B/B₀ %（B/B₀ ×100%）和logit B/B₀ ，求得标准ABA浓度对抗体和³ H—ABA结合的竞争抑制率。以各标准管竞争抑制率（y轴）对2—cis( ) ABA浓度（x轴）作图，绘制出如图22、23的标准竞争抑制曲线。将B₀ 管33—35%的B%值定为抗血清工作浓度可以得到最为灵敏的标准曲线(r=－0.0981)，精确度和准确度也较好。检测极限是0.18×10—¹² mol，抑制B/B₀ 50%需1.047pg，测定范围达18×10—¹² mol。表2为一组制作标准竞争抑制曲线实验数据处理的例子。

　

　　样品管Bcpm换算成B/F或B%或B/B₀ %和logitB/B₀ 后，即可直接从具有相关、回归和贮茂功能的电子计算器上，或者从标准曲线上查出ABA含量，再按下式算出试样^F ABA含量和^c ABA含量。由于内源^c ABA主要是ABA—GE，抗体和ABA—GE的亲和力大于抗体和ABA的亲各力，因此计算试样^c ABA含量时还应乘以交叉反应的折算系数1.46。

　

　　其中：3为提取液体积ml。

　　0.1为分离、萃取用样液体积。

　　本实验约需6─8小时。