实验87 华氏呼吸计

 

实验87 华氏呼吸计

 

原理

 

　　动、植物细胞和组织的许多代谢过程，往往发生气体变化，其变化的速度，可以用测压计法来测定，华氏呼吸计是实验室中常用的测压法。测压法的原理是，在固定体积并保持温度一定的密闭系统中，气体数量上的变化（产生或消失），可以从此系统中气体压力的变化进行测量。气体产生或消失的总量，可以按照气体定律求得。

 

仪器的构造

 

　　国产SKW—2型微量呼吸计，其测量的主要部分为玻璃制的反应瓶以及与其相连的压力计（图36）。反应瓶的底部中央装有小玻璃杯，有的还具有一个或二个侧管（图37，S），反应瓶通过磨砂口与压力计(M)相连，压力计为一U形毛细玻璃管，上有刻度，固定在金属板上，金属板插在回旋振荡装置上，使反应瓶完全浸没在恒温的水槽中。压力计的下口连接一段乳胶管，乳胶管的另一端用玻璃棒塞住，乳胶管和压力计中充满Brodie溶液，借螺旋(L)可以调节Brodie溶液在压力计中的高度，当三通活塞(T)关闭时，整个反应瓶系统就严密地封闭起来，为使实验在一恒定的条件下进行，所以仪器还附设有恒温水槽、温度控制器、搅拌器、回旋振荡器等部分。

　

仪器使用前的准备

 

　　1．Brodie溶液

　　取NaCl23g及胆酸钠（sodium choleate）5g溶于500ml水中，另加伊凡氏蓝（Evans blue）少许（200mg/L）使溶液着色，并加浓麝香草酚酒精溶液数滴作为防腐剂。该溶液的比重为1.033，液柱高10000mm时的压力等于101 325 Pa（1标准大气压）。

　　2．清洗压力计与反应瓶

　　新购得的压力计及反应瓶在使用前要经过清洗，简便的方法是用洗液浸泡，将配好的洗液倒在一高型标本瓶或大量筒中，插入压力计，先将直管部分浸泡数小时，然后再浸洗侧管部分，如果容器的口径不够大，可把压力计倒置于玻璃缸中，关闭活塞，用毛细滴管注洗液于压力计的侧管部分，浸泡数小时，用水冲洗干净，然后于80℃烘箱中烘干。新的反应瓶，也同样可以用洗液浸泡，然后用水冲洗干净烘干。

　　如果刚用过的反应瓶，应先用吸水纸将瓶口的真空油脂擦去，然后用热肥皂水或洗涤剂浸泡数小时，再用水冲洗，烘干。

　　3．测量反应瓶体积

　　测量反应瓶的体积，一般采用重量法，将欲测其体积的空间充满水银，然后称得水银的重量，再根据水银的密度，换算成体积。

　　(1)水银的净化：久藏的水银在表面往往有一层氧化物，可先用竹夹（印照片用）夹少许脱脂棉，把氧化物擦在脱脂棉上，然后将脱脂棉放在10%HNO3中洗净，这样经过多次即可擦除掉表面氧化物，使表面显得光洁，然后再用水银洗涤器在10%HNO3中清洗数次，再换水洗涤至中性，收集在烧杯中，用滤纸吸干表面水分，即可备用。

　　(2)体积的测定：所需要测定的体积系指反应瓶连接在压力计上关闭活塞之后，右侧压力计自150mm至反应瓶连接之间的体积。

　　 取一干洁的反应瓶于链条天平上称其重量，准确度达10mg即可，于瓶中装上适量的干净水银，水银的量以反应瓶连接在压力计的磨砂接头上时，水银在毛细管中的位置恰好在压力计侧管的水平部分为度，在玻璃管外壁做上记号（图38中m），取下反应瓶立即用温度计测量水银的温度，然后再称其重量，前后两次重量之差即为水银的重量。

　　 测量好反应瓶一端的体积之后，再行测量在压力计上余下的体积。为此将压力计用铁夹固定在铁架上（图38），取一段乳胶管，一端用玻璃棒塞住，乳胶管中装满水银，然后将其连在压力计上，打开活塞，此时水银即进入压力计的毛细管中，用手压挤乳胶管中的水银，同时调节压力计的倾斜度，使得毛细管中的水银高度恰好在刻度150mm及所做记号m处，关闭活塞，取下乳胶管，倒出压力计中的水银，小心将活塞平拉出，则活塞下端毛细管内的水银很易流入收集杯中，而避免活塞孔中的水银混入，最后称得水银的重量。

 

　　将反应瓶部分和压力计部分水银重量加在一起，用该温度的水银密度除之，即得水银的体积，亦即欲求的反应瓶体积（水银密度见附表15）。

　　4．反应瓶常数K的计算

　　反应瓶常数K即代表压力计上每变化1mm时，反应系统中气体的变化量，根据气体定律，我们就可以计算出K值的大小。

　　设X为试验前后反应系统中气体变化的体积（标准状况下），以μl表示之。

　　h为压力计读数，以mm表示之，

　　V_g 为反应瓶中气体体积（包括压力计的连接侧管至150mm处），以μl表示之，

　　V_f 为反应瓶中液体的体积，以μl表示之，

　　P为开始时反应瓶中某待测气体的分压力，

　　R为温度T时的水蒸汽压力，

　　P₀ 为标准压力，即101325Pa（如以Brodie溶液表示，则P₀ =10000mm Brodie液柱高，

　　T为水槽的温度，以绝对温度表示之，

　　a为待测气体的溶解度（压力为101325Pa，温度为T时）（见附表14）。

　　根据气体定律公式：

 

　　反应瓶中气相的气压为P—R，体积为V_g ，如换算成标准状况，则为：

　　 　　　

　　而试验开始时有部分气体溶于液相中，其数量为

 

　　所以试验开始时，气相及液相中的气体总量（体积）应为：

 

　　当试验结束时，气体体积发生变化，设变化量为x，结果引起系统中压力变化hmm，如果气体被吸收，则h为负，如气体释放，则h为正。今假定气体被吸收，则试验结束时压力应为（P—R—h），因而此时气体总量为：

 

　　所以

 

　　K即为反应瓶常数，其数值与V_g 、V_f 以及T有关，所以每一反应瓶的K不同，即使同一反应瓶，试验条件不同（如温度，材料用量等），其K值也不同，这是应该注意的。

 

使用举例

 

　　今以测定发芽小麦种子的呼吸强度和呼吸商为例。

　　1．选取种子大小和芽长相似的发芽小麦40粒，分成4组，分别放在4只反应瓶中，每瓶10粒，于其中2只反应瓶的中央小杯中加入10%NaOH0.2ml，以吸收释放的CO₂ 测定呼吸作用吸收的O₂ 量。另外2只不加NaOH，以测定呼吸作用放出的CO₂ 和吸收的O₂ 。另外再取反应瓶1只，作为空压管，以校正试验过程中外界温度和压力的变化对试验结果的影响。所有反应瓶分别装在压力计上，浸于恒温水浴中。

　　2．调节温度控制器，使水浴温度为 25℃。开启振荡器，选择合适的频率。打开压力计上的活塞T，使与大气相通，15分钟后当反应瓶内外温度平衡时。调节螺旋L，使压力计右管的高度为150mm，记下左管高度读数，此即为试验开始时（0分钟）的读数，关闭活塞T，开始试验，并记时。

　　3．15分钟（视材料和试验要求而定）后，再进行读数，读数时先用螺旋L调节右管高度为150mm，记下左管的读数，根据需要间隔一定时间后可再行读数。

　　4．试验结束后，取出各反应瓶中的种子，于量筒中用水位取代法，测量种子的体积。

　　5．287页表的上半部分为试验记录，下半部分系根据记录计算的结果。

　　6．计算

　　(1)O₂ 吸收量：由于2号和9号瓶中加有NaOH，呼吸作用放出的CO₂ 被其吸收，所以试验前后反应瓶中压力的变化完全由于O₂ 被吸收所致。根据公式(2)即可计算O₂ 吸收量，以2号瓶为例，根据(1)式先计算得K_{O 2 O 2} ＝K·h，计算X_O2 ，其中h为负，所以X_{O 2} ＝1.71×(－53)=—90.63μl同样计算得9号瓶的X_O2 =—96.66μl两数的平均值为—93.64μl。

　　(2)CO₂ 释放量：4号和17号瓶中没有加NaOH，试验前后反应瓶中压力的变化，是由于O₂ 吸收和CO₂ 释放，两者体积变化之和所引起。

　　 由于O₂ 被吸收所引起的压力变化为：

 

　　材料：发芽小麦种子

　　试验温度：25℃

　　试验日期：______年______月______日

 

　　而由于CO₂ 的放出所引起的压力变化为：

 

　　所以反应瓶压力计最后读数h为：

 

　

　　　　　　　

　　

　　(3)式中的xo₂ 已从2号和9号瓶中得到，其平均值为—93.64μl，而Ko₂ 和Kco₂ 为2号和9号瓶的常数，可以计算得到，由于V_f =0，所以Ko₂ 和Kco₂ 值实际相等。根据公式(1)计算得4号瓶的Ko₂ ＝Kco₂ ＝2.14，根据公式(3)：

 

　　同样计算得17号瓶的K_{o 2} （Kco₂ ）=2.17，xco₂ =80.62μl，两数平均为84.99μl。