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光学显微镜

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实验一 光学显微镜 

  在本实验课中,经常需要使用光学显微镜(以下简称显微镜)观察植物体内的各种结构。因此在实验课开始之前,必须先了解显微镜的结构、成象原理和操作规程,并掌握正确的使用方法。

  如果不了解上述情况,在实验课中不仅不能充分发挥显微镜的设计性能,而且容易发生损坏显微镜和压破盖玻片等事故。

  (一)显微镜的结构

  显微镜的种类很多,有的简单、有的复杂,而且各有专门用途。这里所介绍的是复式显微镜,它是植物学实验课中最常用的光学仪器。复式显微镜的式样虽有不同,但它们的基本结构相同,都是由光学部分和机械部分组成(图1-1)。

  光学部分包括:物镜、目镜、镜筒、聚光器和反光镜。

  机械部分包括:镜头转换器,粗聚焦器(用作初步聚焦)、细聚焦器(用作更精确的聚焦)、执手、镜台(也称为载物台、上面装有压片夹)、镜座和倾斜关节。

  (二)显微镜的成象原理

  光学显微镜是利用光学的成象原理,观察植物体结构的。首先利用反光镜将可见光(自然光或灯光光源)反射到聚光器中,把光线会聚成束,穿过生物制片(样品),进入到物镜的透镜上。因此所观察的制片都要很薄(一般为8—10微米厚),光线才能够穿透制片,经过物镜将制片上的结构放大为倒的实象。这一倒的实象经过目镜的放大,映入眼球内最后为放大的倒的虚象(图1-2)。

 

  从成象的原理看,物镜在成象过程中起主要作用。因此,物镜质量的优劣直接影响成象的清晰程度,目镜只不过是放大物镜所成的象,而不能增加成象的清晰度。

  聚光器的作用是集中反光镜反射的光线,使光线会聚而得到强的光束。升降聚光器,可调节焦点。聚光器上还附有光圈,用以调节进入物镜的光线。

  (三)显微镜的放大倍数

  显微镜放大的倍数是由目镜、物镜和镜筒的长度所决定。镜筒长度一般为160毫米,常用的显微镜,物镜与目镜上都刻有放大倍数(一般目镜越短,放大倍数越高;物镜越长,放大倍数越高),如物镜上刻有10×、20×、40×和90×等;目镜上刻有5×、10×、15×和25×等。物体最后被放大的倍数为目镜和物镜二者放大倍数的乘积。

  

  理论上显微镜的最大放大倍数可以达到两千多倍,但是目前不仅由于受分辨率的限制,并且还由于制造工艺水平的限制,最好的显微镜的最高有效放大倍数,只能达到一千倍左右。因此有时说一架显微镜可以放大两千倍,这只不过是能够“放大”而已,并不能说明它的清晰程度增大,也许只看见一个放大的模糊形象。

  (四)使用显微镜的操作规程

  1.自显微镜柜子或木盒内取出时,要用右手握紧执手,把显微镜轻轻拿出。由于镜体较重,必须用左手托住镜座,才能做较远距离的搬动。

  2.将显微镜置于实验台上时,应放在身体的左前方,离桌子边缘约30毫米处。右侧可放记录本或绘图纸等。

  3.使用显微镜前,首先要调节好光源。在实验室中可利用灯光或自然光,但不能用直射的阳光,以免损伤眼睛。

  为了迅速而正确地对光,应先用10×物镜,把光圈放到最大位置。在用眼睛观察目镜中视野的同时,转动反光镜,使视野的光线最明亮、最均匀。如果靠近光源,可用平面的反光镜;如果光源距离较远,可用凹面的反光镜。有的显微镜如不具有聚光器,则应用凹面的反光镜。

  4.把制片放在显微镜的镜台上,要观察的部位应准确地移到物镜的下面,然后用压片夹压紧。

  5.观察时要睁开双眼,用左眼观察显微镜目镜视野中的象。

  6.进行观察时,应先用10×物镜。为了避免物镜压坏制片(在使用高倍物镜时最易发生),必须用下面方法聚焦:即一方面从侧面注视物镜与制片间的距离;一方面转动粗聚焦器,使镜筒逐渐下降,直到接近盖玻片为止。然后用左眼观察目镜视野,慢慢转动粗聚焦器使镜筒逐渐上升,直到看清制片中的影象为止。

  观察制片时,首先在低倍物镜下了解制片上切片的概况,如果所要观察部分位于视野的一侧,则要移动制片,将要观察的部位移到中央。移动制片时应注意显微镜中所形成的象是倒象,因此要改变图象在视野中的位置时,需向相反的方向移动制片。

  有的显微镜带有4×物镜,使用时其焦距与10×和40×物镜不同,因此当由4×物镜转换为10×物镜观察制片时,需要重新聚焦。

  7.细聚焦器是显微镜上最易损坏的部件之一,要尽量保护。一般用低倍物镜观察时,用粗聚焦器就可以调好焦距,不用或尽量少用细聚焦器。使用高倍物镜如需要用细聚焦器聚焦时,其旋钮转动量最好不要大于半圈。

  8.需详细观察制片中某一部分细微结构时,可先在低倍物镜下找到最合适的地方,并移至视野中央,然后转动镜头转换器用高倍物镜(40×或44×)观察。当换到高倍物镜后,应该看到制片中的影象。如果影象不清楚时,顺时针或逆时针方向转动细聚焦器,直到影象清晰为止。如果转换高倍物镜后看不到影象,可能所观察的对象没有在视野中央的位置,需要转换到低倍物镜,重新调正制片位置。

  当影象看到以后,还要用光圈调节光束的粗细。这一点很重要,如果光束过于粗大,光线过强,将使一些较为透明的结构不易看清;如果光束过细,光量不足,将使影象灰暗不清。因此必须调节光圈,达到最好的观察效果。在调节光圈时,不要触动反光镜,以免改变光线的折射方向。

  (五)使用显微镜时必须遵守的规则

  1.任何旋钮转动有困难时,绝不能用力过大,而应查明原因,排除障碍。如果自己不能解决时,要向指导教师说明,帮助解决。

  2.保持显微镜的清洁,尽量避免灰尘落到镜头上,否则容易磨损镜头。必须尽量避免试剂或溶液沾污或滴到显微镜上,这些都能损坏显微镜。特别是高倍物镜很容易被染料或试剂沾污,如被沾污时,应立即用擦镜纸擦拭干净。显微镜用过后,应用清洁棉布轻轻擦拭(不包括物镜和目镜镜头)。

  3.要保护物镜、目镜和聚光器中的透镜。光学玻璃比一般玻璃的硬度小,易于损伤。擦拭光学透镜时,只能用专用的擦镜纸,不能用棉花,棉布或其它物品擦拭。擦时要先将擦镜纸折叠为几折(不少于四折),从一个方向轻轻擦拭镜头,每擦一次,擦镜纸就要折叠一次。然后绕着物镜或目镜的轴旋转地轻轻擦拭。如不按上述方式擦拭,落在镜头上的灰尘很易损伤透镜,出现一条条的划痕。

  4.每次实验结束时,应将物镜转成八字形垂于镜筒下,以免物镜镜头下落与聚光器相碰撞。也可用清洁的白纱布,垫在镜台与物镜之间。

  (六)操作练习

  对显微镜的构造和使用方法有初步了解后,可以进行下列操作练习:

  1.用“上”字制片 在低倍物镜下观察(图1-3,下),掌握对光和聚焦器的使用方法。找到观察的物象后,用聚焦器把物象调节到最清晰程度。验证一下放大的物象是否为倒象?把制片向左和向右移动,物象移动的方向是否与制片移动的方向一致?为什么?

  2.用“绢”制片 (图1-3,上),计算视野直径在高倍物镜和低倍物镜下各有多少方格,计算其放大倍数是否与物镜放大倍数成正比。

  3.用“绢”制片测量不同放大倍数下,视野的直径。首先在“绢”制片上找出黑色斑点的标记(用肉眼就可以看出,这是在制片时做的,每两黑点之间为1毫米)。数一数两黑点之间有多少小方格,然后分别在4×、10×、40×(或44×)物镜下(目镜放大倍数不变)计算视野直径的方格数目,并按方格数目多少粗略地计算出三种物镜下视野直径的大小。把计算结果记录下来,可帮助在观察实物时,建立放大倍数的概念。

  4.在载玻片上滴一滴稀胶水,用解剖针搅拌使产生小的气泡,加盖玻片后在显微镜下观察。在显微镜下看到的气泡,其外围为一黑圈,中间为明亮部分。应该记住气泡在显微镜下的形象,在以后的实验中,不要把气泡误认为植物组织中的结构,这往往是初学人容易发生的错误。

 

  5.在载玻片上放一滴含有浮游生物的水,然后轻轻加上盖玻片。盖玻片一定要擦拭清洁,否则将影响观察。加盖玻片时要小心,先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘接触,然后自一侧轻轻盖下。如果突然放下盖玻片,将会产生气泡影响观察。

  观察浮游生物时,一定要按上述的操作程序进行。先在10×物镜下观察浮游生物的游动情况,并试着移动载玻片追踪游动的浮游生物。最后在高倍物镜下观察,并改变光圈的大小,了解其对物象的影响。

  

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