光学显微镜

 

实验一 光学显微镜　

　　在本实验课中，经常需要使用光学显微镜（以下简称显微镜）观察植物体内的各种结构。因此在实验课开始之前，必须先了解显微镜的结构、成象原理和操作规程，并掌握正确的使用方法。

　　如果不了解上述情况，在实验课中不仅不能充分发挥显微镜的设计性能，而且容易发生损坏显微镜和压破盖玻片等事故。

　　（一）显微镜的结构

　　显微镜的种类很多，有的简单、有的复杂，而且各有专门用途。这里所介绍的是复式显微镜，它是植物学实验课中最常用的光学仪器。复式显微镜的式样虽有不同，但它们的基本结构相同，都是由光学部分和机械部分组成（图1-1）。

　　光学部分包括：物镜、目镜、镜筒、聚光器和反光镜。

　　机械部分包括：镜头转换器，粗聚焦器（用作初步聚焦）、细聚焦器（用作更精确的聚焦）、执手、镜台（也称为载物台、上面装有压片夹）、镜座和倾斜关节。

　　（二）显微镜的成象原理

　　光学显微镜是利用光学的成象原理，观察植物体结构的。首先利用反光镜将可见光（自然光或灯光光源）反射到聚光器中，把光线会聚成束，穿过生物制片（样品），进入到物镜的透镜上。因此所观察的制片都要很薄（一般为8—10微米厚），光线才能够穿透制片，经过物镜将制片上的结构放大为倒的实象。这一倒的实象经过目镜的放大，映入眼球内最后为放大的倒的虚象（图1-2）。

　

 

　　从成象的原理看，物镜在成象过程中起主要作用。因此，物镜质量的优劣直接影响成象的清晰程度，目镜只不过是放大物镜所成的象，而不能增加成象的清晰度。

　　聚光器的作用是集中反光镜反射的光线，使光线会聚而得到强的光束。升降聚光器，可调节焦点。聚光器上还附有光圈，用以调节进入物镜的光线。

　　（三）显微镜的放大倍数

　　显微镜放大的倍数是由目镜、物镜和镜筒的长度所决定。镜筒长度一般为160毫米，常用的显微镜，物镜与目镜上都刻有放大倍数（一般目镜越短，放大倍数越高；物镜越长，放大倍数越高），如物镜上刻有10×、20×、40×和90×等；目镜上刻有5×、10×、15×和25×等。物体最后被放大的倍数为目镜和物镜二者放大倍数的乘积。

　　

　　理论上显微镜的最大放大倍数可以达到两千多倍，但是目前不仅由于受分辨率的限制，并且还由于制造工艺水平的限制，最好的显微镜的最高有效放大倍数，只能达到一千倍左右。因此有时说一架显微镜可以放大两千倍，这只不过是能够“放大”而已，并不能说明它的清晰程度增大，也许只看见一个放大的模糊形象。

　　（四）使用显微镜的操作规程

　　1．自显微镜柜子或木盒内取出时，要用右手握紧执手，把显微镜轻轻拿出。由于镜体较重，必须用左手托住镜座，才能做较远距离的搬动。

　　2．将显微镜置于实验台上时，应放在身体的左前方，离桌子边缘约30毫米处。右侧可放记录本或绘图纸等。

　　3．使用显微镜前，首先要调节好光源。在实验室中可利用灯光或自然光，但不能用直射的阳光，以免损伤眼睛。

　　为了迅速而正确地对光，应先用10×物镜，把光圈放到最大位置。在用眼睛观察目镜中视野的同时，转动反光镜，使视野的光线最明亮、最均匀。如果靠近光源，可用平面的反光镜；如果光源距离较远，可用凹面的反光镜。有的显微镜如不具有聚光器，则应用凹面的反光镜。

　　4．把制片放在显微镜的镜台上，要观察的部位应准确地移到物镜的下面，然后用压片夹压紧。

　　5．观察时要睁开双眼，用左眼观察显微镜目镜视野中的象。

　　6．进行观察时，应先用10×物镜。为了避免物镜压坏制片（在使用高倍物镜时最易发生），必须用下面方法聚焦：即一方面从侧面注视物镜与制片间的距离；一方面转动粗聚焦器，使镜筒逐渐下降，直到接近盖玻片为止。然后用左眼观察目镜视野，慢慢转动粗聚焦器使镜筒逐渐上升，直到看清制片中的影象为止。

　　观察制片时，首先在低倍物镜下了解制片上切片的概况，如果所要观察部分位于视野的一侧，则要移动制片，将要观察的部位移到中央。移动制片时应注意显微镜中所形成的象是倒象，因此要改变图象在视野中的位置时，需向相反的方向移动制片。

　　有的显微镜带有4×物镜，使用时其焦距与10×和40×物镜不同，因此当由4×物镜转换为10×物镜观察制片时，需要重新聚焦。

　　7．细聚焦器是显微镜上最易损坏的部件之一，要尽量保护。一般用低倍物镜观察时，用粗聚焦器就可以调好焦距，不用或尽量少用细聚焦器。使用高倍物镜如需要用细聚焦器聚焦时，其旋钮转动量最好不要大于半圈。

　　8.需详细观察制片中某一部分细微结构时，可先在低倍物镜下找到最合适的地方，并移至视野中央，然后转动镜头转换器用高倍物镜（40×或44×）观察。当换到高倍物镜后，应该看到制片中的影象。如果影象不清楚时，顺时针或逆时针方向转动细聚焦器，直到影象清晰为止。如果转换高倍物镜后看不到影象，可能所观察的对象没有在视野中央的位置，需要转换到低倍物镜，重新调正制片位置。

　　当影象看到以后，还要用光圈调节光束的粗细。这一点很重要，如果光束过于粗大，光线过强，将使一些较为透明的结构不易看清；如果光束过细，光量不足，将使影象灰暗不清。因此必须调节光圈，达到最好的观察效果。在调节光圈时，不要触动反光镜，以免改变光线的折射方向。

　　（五）使用显微镜时必须遵守的规则

　　1．任何旋钮转动有困难时，绝不能用力过大，而应查明原因，排除障碍。如果自己不能解决时，要向指导教师说明，帮助解决。

　　2．保持显微镜的清洁，尽量避免灰尘落到镜头上，否则容易磨损镜头。必须尽量避免试剂或溶液沾污或滴到显微镜上，这些都能损坏显微镜。特别是高倍物镜很容易被染料或试剂沾污，如被沾污时，应立即用擦镜纸擦拭干净。显微镜用过后，应用清洁棉布轻轻擦拭（不包括物镜和目镜镜头）。

　　3．要保护物镜、目镜和聚光器中的透镜。光学玻璃比一般玻璃的硬度小，易于损伤。擦拭光学透镜时，只能用专用的擦镜纸，不能用棉花，棉布或其它物品擦拭。擦时要先将擦镜纸折叠为几折（不少于四折），从一个方向轻轻擦拭镜头，每擦一次，擦镜纸就要折叠一次。然后绕着物镜或目镜的轴旋转地轻轻擦拭。如不按上述方式擦拭，落在镜头上的灰尘很易损伤透镜，出现一条条的划痕。

　　4．每次实验结束时，应将物镜转成八字形垂于镜筒下，以免物镜镜头下落与聚光器相碰撞。也可用清洁的白纱布，垫在镜台与物镜之间。

　　（六）操作练习

　　对显微镜的构造和使用方法有初步了解后，可以进行下列操作练习：

　　1．用“上”字制片① 在低倍物镜下观察（图1-3，下），掌握对光和聚焦器的使用方法。找到观察的物象后，用聚焦器把物象调节到最清晰程度。验证一下放大的物象是否为倒象？把制片向左和向右移动，物象移动的方向是否与制片移动的方向一致？为什么？

　　2.用“绢”制片② （图1-3，上），计算视野直径在高倍物镜和低倍物镜下各有多少方格，计算其放大倍数是否与物镜放大倍数成正比。

　　3．用“绢”制片测量不同放大倍数下，视野的直径。首先在“绢”制片上找出黑色斑点的标记（用肉眼就可以看出，这是在制片时做的，每两黑点之间为1毫米）。数一数两黑点之间有多少小方格，然后分别在4×、10×、40×（或44×）物镜下（目镜放大倍数不变）计算视野直径的方格数目，并按方格数目多少粗略地计算出三种物镜下视野直径的大小。把计算结果记录下来，可帮助在观察实物时，建立放大倍数的概念。

　　4．在载玻片上滴一滴稀胶水，用解剖针搅拌使产生小的气泡，加盖玻片后在显微镜下观察。在显微镜下看到的气泡，其外围为一黑圈，中间为明亮部分。应该记住气泡在显微镜下的形象，在以后的实验中，不要把气泡误认为植物组织中的结构，这往往是初学人容易发生的错误。

　

　　5．在载玻片上放一滴含有浮游生物的水，然后轻轻加上盖玻片。盖玻片一定要擦拭清洁，否则将影响观察。加盖玻片时要小心，先将盖玻片的一边与载玻片上的水滴边缘接触，然后自一侧轻轻盖下。如果突然放下盖玻片，将会产生气泡影响观察。

　　观察浮游生物时，一定要按上述的操作程序进行。先在10×物镜下观察浮游生物的游动情况，并试着移动载玻片追踪游动的浮游生物。最后在高倍物镜下观察，并改变光圈的大小，了解其对物象的影响。