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反义RNA的人工合成

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  既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用,那末人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达,想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。

  1.由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少,因此,在要设计Ⅱ类反义RNA用于和靶mRNASD序列上游区结合,以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。

  2.Ⅲ类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此,要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列,就可以设计出反义RNA,与该U序列上游的mRNA链互补,以形成ρ-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5'端上游的非编码区,以免受核糖体的影响。

  3.只要靶基因的核苷酸顺序已经知道,就可以人工设计出Ⅰ类反义RNA。有时还可设计同时具有Ⅰ类和Ⅲ类反义RNA功能的反义RNA。

  我们还可以设计出天然存在的反义RNA的反义RNA来。这样就可以拮抗原始反义RNA对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的Ⅰ类反义RNA都敏感。例如,有的mRNA寿命很短,只有1-2分钟,它们和反义RNA结合的机会较少,因而就较不敏感。反之,另一些mRNA则很稳定,寿命可达十多分种,则其对相应的反义RNA的抑制作用就很敏感。此外,反义RNA本身的稳定性有很大的实际意义。显然,稳定的反义RNA对靶mRNA的调节作用比不稳定的反义RNA要好。

  使反义RNA分子稳定的方法如下:
  [1]反义RNA3'端带有茎环结构或类似ρ-不依赖性终止子结构时,可以稳定RNA分子。
  [2]Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32mRNA的5'端上游的茎环结构及其附近的序列亦可稳定RNA分子。所以在设计反义RNA基因时,最好将产生3'及5'端这种二级结构的序列克隆在反义RNA基因的两端。Hirashima等1986年发现,针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的反义RNA,要比单纯对编码区域的反义RNA更为有效。1989年Hirashima又发现,针对SD序列和它的上游区域(但不包括AUG)的反义RNA更为有效。在真核生物中,针对5'端非编码区的反义RNA更有效。但也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。

  现在设计反义RNA基因是时应注意之点总结如下:
  [1]长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。
  [2]在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。
  [3]在真核生物中,对应于5'端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。
  [4]尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。
  [5]设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框,否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。
  [6]进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3'端尾上,当反义RNA与靶mRNA杂交后,即可利用其酶活性来降解靶mRNA。

  此外,为了增强反义RNA的作用,还可以采取一些额外措施,例如:[1]由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性,所以在构建反义RNA基因时,要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。[2]构建许多个反义RNA基因串连在一起,以得到线性重复的多拷贝基因,对提高反义RNA的表达也有利。[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA杂交体,所以在构建反义RNA基因时,可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样,当反义RNA与靶mRNA结合后,RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。

  近年来,有关反义RNA的研究进展迅速,已经应用到抗病毒感染,研究癌基因的作用机制,探索肿瘤治疗的可行途径等方面。在今后一段时间内,有关反义RNA的研究肯定将会有更加迅速的进展和更广阔的应用前景。

 

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