差异消减展示

差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等针对差异展示的缺点而提出的改进方法。此法可显著降低假阳性，增强重复性及敏感性，同时保持了对轻度、中等程度改变的(up- or down-regulation)RNA的识别。它的最大改进是：在DDRT-PCR呈现出差异条带之后，克隆差异条带之前，先对PCR扩增产物进行消减杂交，即在回收目的方差异条带的同时，回收对照方相应范围的条带。回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTP进行PCR扩增，而对照方回收的产物用含生物素标记的dATP的dNTP进行PCR扩增，其PCR产物进行消减杂交，用链亲和素-生物素磁珠分离系统去除杂交产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTP进行扩增，可重复差异展示，增加差异条带的特异性。实验证明，消减杂交使得轻度、中等程度改变的差异表达基因都能够保留下来，而假阳性产物被去除。其它方面的改进是：① 使用标准的oligo (dT)起始mRNA(不用总RNA)反转录合成cDNA。② 重复性好的双引物扩增所需的cDNA范围很小，摸索合适的cDNA量对重复性很重要。③ 锚定引物具有扩增优势，为了克服这种优势，增加随机引物的浓度后发现，随着随机引物浓度的增加，呈现出的条带数显著减少，这就是引物相互干扰，其原因可能有二：一方面5′端10bp的随机引物不受mRNA 3′端限制，只是提供总的扩增容量；另一方面，mRNA 3′端非翻译区包含AT富集区，使得锚定引物更易结合mRNA 3′端。因此，设计新的增强特异性及灵敏性的锚定引物更加必要。实验证实，使用T12VNN(V=A、C or G;N=A、C、G or T)锚定引物比常规的T12VN锚定引物能呈现出更大量的差异条带，而且具有更强的特异性及灵敏性，T12AA、T12AT、T12CT、T12GT不能产生清晰的差异条带，只能出现smear现象，应避免使用。④ 循环次数太多，引物消耗完后常导致高分子量smear现象。这主要原因是：PCR产物的3′-OH端相互退火，导致PCR循环期间产物末端被延伸或随意终止，因此摸索最佳循环次数及退火温度对消除假阳性更具有意义。此技术最大的优势是获得的差异条带在RNA印迹上重现性好，保持了中等程度改变的差异表达基因的呈现与克隆。特别是长距离PCR扩增技术的运用，使得此技术有可能成为目前筛选差异表达基因最有效的技术。它的唯一不足是步骤繁琐、工作量大。