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多酚氧化酶的提取、纯化和活力测定

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实验原理

 

很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色,这是损伤时植物细胞破碎,原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。反应如下:

+H2 O

多酚氧化酶

+1/2O2

多酚氧化酶(po1yphenoloxidase,PP0)是一种含铜酶,它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来,国内外对植物组织褐变的研究表明,组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致。

实验试剂

 

1. 0.025mol/L磷酸钾缓冲液( pH7.2)

2. 0.15mol/L儿茶酚溶液

3. 10mmol/LTris-HCl溶液(pH8.3)

4. 硫酸铵

实验设备

 

1. 组织匀浆机

2. 漏斗

3. 滤纸

4. 分光光度计

实验材料

 

实验步骤

 

1. 多酚氧化酶(PP0)的提取

   1) 丙酮粉制备:取果肉组织100 g,加入200mL冰丙酮(-20℃左右),用高速组织捣碎机匀浆5min,混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤,残渣用冰丙酮反复冲洗,过滤,直至成为白色粉末,此粉末即为丙酮粉。

   2) 酶液制备:称取1g丙酮粉,加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液( pH7.2),0℃下用磁力搅拌器匀浆30min,在12 000rpm下离心30min,取上清液,得粗酶提取液。

2. 多酚氧化酶(PP0)的纯化

向上述酶液中加入NH4 SO4 至为80%饱和溶液,搅拌30min, 过夜,于12 000g离心30min,沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中(pH7.2), 对10mmol/LTris-HCl溶液(pH8.3)透析18h, 期间更换三次,即为纯化多酚氧化酶。

3. 多酚氧化酶(PP0)活力的测定

以儿茶酚为底物,在1cm的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中(pH7.2), 0.1mL 0.15mol/L儿茶酚溶液,混匀,室温下放置3分钟后,加入0.1mL酶液, 5s后开始扫描1min内A420值的变化,酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。

注意事项

 

多酚氧化酶易失活,提取酶时宜在低温下进行。

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