实验方法｜动植物组织如何提取 mRNA？

丁香实验2013-09-06

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水稻叶片或小鼠肝组织。

研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

1. 无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入 0.01% 的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2. 75% 乙醇：用 DEPC 处理水配制 75% 乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

3. 1× 层析柱加样缓冲液；20 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1% SDS。

4. 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.05% SDS。

（一）动植物总RNA提取- Trizol法

Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染。RNA 可直接用于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。

1. 将组织在液 N 中磨成粉末后，再以 50-100 mg 组织加入 1 ml Trizol 液研磨，注意样品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%。

2. 研磨液室温放置 5 分钟，然后以每 1 mlTrizol 液加入 0.2 ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管 15 秒。

3. 取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol 液加 0.5 ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10分钟，12000 g离心 10 分钟。

4. 弃去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1 ml的比例加入 75% 乙醇，涡旋混匀，4 ℃ 下7500 g离心 5 分钟。

5. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度。然后将 RNA 溶于水中，必要时可 55 ℃-60 ℃ 水溶 10 分钟。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70% 乙醇并保存于 -70 ℃。

[注意]
1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2. 加氯仿前的匀浆液可在 -70 ℃ 保存一个月以上，RNA 沉淀在 70% 乙醇中可在 4 ℃ 保存一周，-20 ℃ 保存一年。

（二）mRNA 提取

由于 mRNA 末端含有多 poly(A)⁺，当总 RNA 流径 oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异的吸附在 oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次 oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。

1. 用 0.1 mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0 g oligo(dT)纤维素。

2. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0 ml，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3. 用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的 pH 值小于 8.0。

4. 将（一）中提取的 RNA 液于 65 ℃ 温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积 2x 柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有 RNA 溶液进入柱床后，加入 1 倍柱床体积的 1x 层析柱加样溶液。

5. 测定每一管的 OD₂₆₀，当洗出液中 OD 为 0 时，加入 2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以 1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。

6. 测定 OD₂₆₀，合并含有 RNA 的洗脱组分。

7. 加入 1/10 体积的 3 M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀， -20 ℃ 30 分钟。

8. 4 ℃ 下 12000 g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70% 乙醇洗涤沉淀，4 ℃ 下 12000 g离心 5 分钟。

9. 小心弃去上清液，沉淀空气干燥 10 分钟，或真空干燥 10 分钟。

10. 用少量水溶解RNA液，即可用于 cDNA 合成（或保存在 70% 乙醇中并贮存于 -70 ℃）。

[注意]
1. mRNA 在 70% 乙醇中 -70 ℃可保存一年以上。

2. oligo(dT) 纤维素柱用后可用 0.3 mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02% 叠氮钠（NaN₃) 冰箱保存，重复使用。每次用前需用 NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。