Protocol of Northern blot

互联网2013-09-06

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Protocol of Northern blot 质粒的转化和扩增 质粒的鉴定 目的基因片段的切割 3.1样品双酶切(175μl水解体系) DW 115μl Buffer B(10×) 17.5μl BaM H 15μl Pst I 17μl DNA(MMP-9) 16μl BSA 4.5μl 37℃水浴，3h。 3.2制胶(1.5%Agarose) 0.6g Agarose+40ml TAE(1×) 3.3电泳 175μl样品+35μl loading buffer(6×) Marker 5μl +DW 20μl + 5μl loading buffer(6×) 3.4目的基因片段的回收（按照北京鼎国生物发展中心的DNA纯化回收手册进行） 3.4.1 切取含DNA片段的琼脂糖（100mg-300mg）捣碎按重量比1：3（DNA片段：溶液B）加入溶液B。 3.4.2 50℃水溶10分钟，直至胶完全溶化，其间旋涡振荡三次，琼脂糖必须完全溶化，如果体积大于500μl，可适当增加溶胶时间，若此时溶液变红，可加15μl NaAc。（亦可不加）。 3.4.3 将溶液置于离心柱中，静置1-2分钟，≥8000rpm离心30S-60S，若一次加不完，可分两次离心。 3.4.4 倒掉液体，加入500μl溶液C（用无水乙醇1：1稀释）于离心柱中，8000rpm 30-60S离心，倒掉液体。 3.4.5 用溶液C（用时乙醇1：1稀释）500μl再洗一遍，8000rpm 离心30-60S。 3.4.6 ≥15000rpm再次离心30S-60S，摔干剩余液体。 3.4.7 将离心柱置于新的离心管中，（此时若离心管盖盖不住，不影响实验结果）加入≥50℃预热30-50μl（取最低值）溶液D，混匀，静置2分钟，≥15000rpm离心60S，管底即DNA。 3.4.8 将DNA贮存于-20℃。 3.5目的基因片段的鉴定 3.5.1电泳（看是否为一条带） 3.5.2 OD值的测定（主要是确定浓度和质量） 子宫组织总RNA的提取（采用Trizol提取法） 4.1匀浆 每50-100mg组织加入1mlTRIzol。样品体积不能超过10%TRIzol体积。匀浆。此步后加入氯仿前可放于-60℃～-70℃至少一个月。 4.2可选（对富含脂肪、蛋白的样品而言） 2-8℃，12000rpm，10分钟。取上清，移入新管。 4.3水相分离 15-30℃孵育5分钟。然后，加入0.2ml氯仿（每1mlTRIzol）。用力摇15秒，15-30℃孵育2-3分钟。2-8℃，12000rpm，15分钟。离心后，RNA在水相。 4.4 RNA沉淀 转移水相入新管（注意，保留有机相用于DNA和蛋白的提取），加入0.5ml异丙醇（每1mlTRIzol），15-30℃孵育10分钟。2-8℃，12000rpm，10分钟。可见RNA沉淀。 4.5 RNA洗涤 弃上清，每1mlTRIzol加入至少1ml 75%乙醇清洗一次沉淀。2-8℃，7500rpm，5分钟。 4.6溶解RNA 室温干燥RNA 5-10分钟。加入100μl DEPC水重溶RNA。贮存于-70℃。 4.7 RNA的鉴定 测定OD260/280，1.7～2.0为好；电泳，观察降解与否，照相。 RNA变性凝胶电泳 5.1制胶 溶化适量Agarose于水中，冷却至60℃，加入5×甲醛凝胶缓冲液（即5×MOPS：0.1M MOPS，40mM乙酸钠，5mM EDTA）和甲醛（PH＞4.0）至最终浓度分别为1×和2.2M。将胶放在制胶板中，室温至少30min。 Agarose 0.4g 去离子水 25ml 60℃溶解后，再加入： 5×MOPS 8ml 甲醛 7.3ml 5.2制备样品 RNA 4.5μl（约10~20μg，RNA体积不足用DEPC水补齐） 5×MOPS 2.0μl 甲醛（约占20%） 3.5μl 去离子甲酰胺（占50%） 10.0μl 65℃孵育样品15min，冰上制冷，离心（样品）5秒，将所有液体沉淀到微型离心管中。 5.3 加1/10体积（2μl）的无菌、DEPC处理的甲醛凝胶上样缓冲液（50%甘油，1mmol/L EDTA,0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF）。 5.4 预电泳5V/cm，5分钟，电泳缓冲液为1×MOPS，预电泳后立即加入样品。 5.5 电泳缓冲液1×MOPS淹没凝胶，电压3~4V/cm（80V，1.5~4h可根据溴酚蓝的位置来确定电泳时间，基本上溴酚蓝快跑完了） 6．转膜 6.1 电泳完毕后，用DEPC水清洗5min×3，以去除甲醛，然后浸泡凝胶于20×SSC中45分钟。 6.2 浸泡尼龙膜于20×SSC中，至少5分钟。 6.3湿式电转移 6.3.1将8张合适大小的滤纸、尼龙膜及海绵在电泳缓冲液（0.5×TBE）中浸透（至少10分钟）。 6.3.2将胶安放在转移架夹中，注意不要留下气泡。安放顺序为：海绵、4张滤纸（一张一张放，并用吸管及时除去气泡）、凝胶、尼龙膜、4张滤纸（每放一层都用0.5×TBE湿润一下）。将转移架夹缓缓地放置在装有电泳缓冲液的转移槽中，使液体慢慢没夹，驱出海绵中的气泡。注意：尼龙膜面向正极栅板。 6.3.3转移：电压为1-4V/CM。先用8V（1V/CM）转移1小时，小片段在低电压下转移较好。然后升压至30V（4V/CM），再转移2小时，使大片段转移彻底。通过紫外光可检查转移效果。 6.3.4结束转移，取出尼龙膜，在电泳缓冲液中漂洗可能粘附的凝胶，浸泡膜于2×SSC中至少5分钟（5~30min）。 6.3.5紫外交联，在基因交联仪中进行，设定如下参数： 湿膜：150mj，13秒，C3 干膜：13秒，C2 如需重复杂交时，勿让膜干透。 7．cDNA的32P末端随机引物标记 7.1 变性25ngDNA（适当增大加入量）溶解在5~20μl 蒸馏水中，沸水浴加热5min，然后立即冰上制冷。 7.2 冰上进行以下操作： 2μl dATP 2μl dGTP 2μl dTTP 10μl 随机引物缓冲液（Random Primer Buffer） 3μl(约50μCi，[α-32P]dCTP，Mixture)3000Ci/mmol,10μCi/μl 加蒸馏水至总体积49μl，短暂振荡。 7.3 加入1μlKlenow片段，缓慢且完全混匀，短暂离心。 7.4 25℃温育1h。 7.5加入5μl终止液。直接用于杂交反应或放于-20℃以备使用，但不可放置太久。 附注：第4步中孵育时间大于1h可以产生较高的特异性。 第5为得到理想结果，超螺旋DNA应在随机引物标记前线粒化或碱变性。 8．杂交 8.1 室温浸泡膜于2×SSC中15分钟。倒掉液体，加入7.5ml预杂交液。65℃预杂交4h。 8.2 沸水浴200ng cDNA探针（于50μl缓冲液中）5~15分钟，然后立即在冰水混合物中致冷。离心。 8.3 倒掉预杂交液，加入10ml新鲜配置的杂交缓冲液，内含10%硫酸葡聚糖（dextran）以及32P标记的探针（每次10ml杂交液中加入5μl 32P标记探针）。垂直放入杂交管底部，摇匀。65℃，在杂交炉中转动杂交25（＞16）小时。 8.4 自然冷却至室温，洗膜30分钟（杂交炉中转动），洗膜液Ⅰ为1×SSC，0.1%SDS。 8.5 60℃，洗膜液Ⅱ中洗膜3×30分钟（杂交炉中转动）。 9．放射自显影 吸干多余的液体，包上可透过紫外线的塑料保鲜膜，在暗室中将杂交膜和X光片放入增感屏内，密封后放在-80℃中，48小时。 10．显影和定影 暗室中显影13分钟，定影30分钟。 11．洗掉探针 用50mL洗膜液Ⅲ于65℃，2×30分钟。用2×SSC室温漂洗5min×2。 Northern Blot 实验过程中所用到的试剂配方： ―――――杂交前―――― 1．5×MOPS，500ml 0.1M MOPS 0.04M NaAc 0.005M EDTA 在400mL的DEPC水中溶解11.56g MOPS，用HAc或NaOH调节PH至7.0，然后加入2.72g NaAc及5mL 0.5M EDTA，用DEPC水定容至500mL，用0.22μm的滤膜过滤除菌，避光保存。 2．0.5M EDTA（PH8.0），50 mL EDTA 7.306g DEPC水 45mL 用NaOH调至PH8.0，补加DEPC水到50 mL 3．甲醛凝胶上样缓冲液（约20μL，即 loading buffer） 50% 甘油 1mM EDTA（PH8.0） 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 4．1×MOPS，500mL 5×MOPS 100mL DEPC水 400mL 5．20×SSC，1000mL 3M 175.3g NaCl 0.3M 88.2g 柠檬酸三钠・2H20（88g/L） 用1M HCL调PH7.0，定容到1000mL 6．2×SSC，500 mL 20×SSC 50mL DEPC水 450 mL 7．5×TBE ，400mL 21.6克 Tris碱 11.0克硼酸 8mL 0.5M EDTA PH8.0 加DEPC水至400mL，出现沉淀后废弃。 8．1×TBE，1000mL 10×TBE 100mL DEPC水 900mL ――――――杂交时――――― 1．2×SSC 2．预杂交液，50mL DEPC水 30mL SDS 3.5g Na2HPO4・12H2O 2.45g NaH2PO4(NaH2PO4・2H2O) 0.38g(0.494g) 0.5M EDTA 100μL BSA 0.5g 去离子甲酰胺 7.5mL 加无离子水至50mL ――――――杂交后―――――― 1．洗膜液Ⅰ，500mL 1×SSC 500mL 0.1%SDS 0.5g 2．洗膜液Ⅱ，2000mL(500mL) NaH2PO4・2H2O 2.465g (0.62g) 25mM Na2HPO4・12H2O 12.248g (3.06g) 25mM EDTA 0.584g (0.146g) 1mM SDS 20g (5g) 1% 加水至 2000mL (500mL) 3．洗膜液Ⅲ，500mL Na2HPO4・12H2O(10mM) 1.79g DW to 250mL 约1mL磷酸调PH7.0 去离子甲酰胺(50%) 250mL