Protocol of Northern blot
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Protocol of Northern blot
质粒的转化和扩增
质粒的鉴定
目的基因片段的切割
3.1样品双酶切(175μl水解体系)
DW 115μl
Buffer B(10×) 17.5μl
BaM H 15μl
Pst I 17μl
DNA(MMP-9) 16μl
BSA 4.5μl
37℃水浴,3h。
3.2制胶(1.5%Agarose)
0.6g Agarose+40ml TAE(1×)
3.3电泳
175μl样品+35μl loading buffer(6×)
Marker 5μl +DW 20μl + 5μl loading buffer(6×)
3.4目的基因片段的回收(按照北京鼎国生物发展中心的DNA纯化回收手册进行)
3.4.1 切取含DNA片段的琼脂糖(100mg-300mg)捣碎按重量比1:3(DNA片段:溶液B)加入溶液B。
3.4.2 50℃水溶10分钟,直至胶完全溶化,其间旋涡振荡三次,琼脂糖必须完全溶化,如果体积大于500μl,可适当增加溶胶时间,若此时溶液变红,可加15μl NaAc。(亦可不加)。
3.4.3 将溶液置于离心柱中,静置1-2分钟,≥8000rpm离心30S-60S,若一次加不完,可分两次离心。
3.4.4 倒掉液体,加入500μl溶液C(用无水乙醇1:1稀释)于离心柱中,8000rpm 30-60S离心,倒掉液体。
3.4.5 用溶液C(用时乙醇1:1稀释)500μl再洗一遍,8000rpm 离心30-60S。
3.4.6 ≥15000rpm再次离心30S-60S,摔干剩余液体。
3.4.7 将离心柱置于新的离心管中,(此时若离心管盖盖不住,不影响实验结果)加入≥50℃预热30-50μl(取最低值)溶液D,混匀,静置2分钟,≥15000rpm离心60S,管底即DNA。
3.4.8 将DNA贮存于-20℃。
3.5目的基因片段的鉴定
3.5.1电泳(看是否为一条带)
3.5.2 OD值的测定(主要是确定浓度和质量)
子宫组织总RNA的提取(采用Trizol提取法)
4.1匀浆
每50-100mg组织加入1mlTRIzol。样品体积不能超过10%TRIzol体积。匀浆。此步后加入氯仿前可放于-60℃~-70℃至少一个月。
4.2可选(对富含脂肪、蛋白的样品而言)
2-8℃,12000rpm,10分钟。取上清,移入新管。
4.3水相分离
15-30℃孵育5分钟。然后,加入0.2ml氯仿(每1mlTRIzol)。用力摇15秒,15-30℃孵育2-3分钟。2-8℃,12000rpm,15分钟。离心后,RNA在水相。
4.4 RNA沉淀
转移水相入新管(注意,保留有机相用于DNA和蛋白的提取),加入0.5ml异丙醇(每1mlTRIzol),15-30℃孵育10分钟。2-8℃,12000rpm,10分钟。可见RNA沉淀。
4.5 RNA洗涤
弃上清,每1mlTRIzol加入至少1ml 75%乙醇清洗一次沉淀。2-8℃,7500rpm,5分钟。
4.6溶解RNA
室温干燥RNA 5-10分钟。加入100μl DEPC水重溶RNA。贮存于-70℃。
4.7 RNA的鉴定
测定OD260/280,1.7~2.0为好;电泳,观察降解与否,照相。
RNA变性凝胶电泳
5.1制胶
溶化适量Agarose于水中,冷却至60℃,加入5×甲醛凝胶缓冲液(即5×MOPS:0.1M MOPS,40mM乙酸钠,5mM EDTA)和甲醛(PH>4.0)至最终浓度分别为1×和2.2M。将胶放在制胶板中,室温至少30min。
Agarose 0.4g
去离子水 25ml
60℃溶解后,再加入:
5×MOPS 8ml
甲醛 7.3ml
5.2制备样品
RNA 4.5μl(约10~20μg,RNA体积不足用DEPC水补齐)
5×MOPS 2.0μl
甲醛(约占20%) 3.5μl
去离子甲酰胺(占50%) 10.0μl
65℃孵育样品15min,冰上制冷,离心(样品)5秒,将所有液体沉淀到微型离心管中。
5.3 加1/10体积(2μl)的无菌、DEPC处理的甲醛凝胶上样缓冲液(50%甘油,1mmol/L EDTA,0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF)。
5.4 预电泳5V/cm,5分钟,电泳缓冲液为1×MOPS,预电泳后立即加入样品。
5.5 电泳缓冲液1×MOPS淹没凝胶,电压3~4V/cm(80V,1.5~4h可根据溴酚蓝的位置来确定电泳时间,基本上溴酚蓝快跑完了)
6.转膜
6.1 电泳完毕后,用DEPC水清洗5min×3,以去除甲醛,然后浸泡凝胶于20×SSC中45分钟。
6.2 浸泡尼龙膜于20×SSC中,至少5分钟。
6.3湿式电转移
6.3.1将8张合适大小的滤纸、尼龙膜及海绵在电泳缓冲液(0.5×TBE)中浸透(至少10分钟)。
6.3.2将胶安放在转移架夹中,注意不要留下气泡。安放顺序为:海绵、4张滤纸(一张一张放,并用吸管及时除去气泡)、凝胶、尼龙膜、4张滤纸(每放一层都用0.5×TBE湿润一下)。将转移架夹缓缓地放置在装有电泳缓冲液的转移槽中,使液体慢慢没夹,驱出海绵中的气泡。注意:尼龙膜面向正极栅板。
6.3.3转移:电压为1-4V/CM。先用8V(1V/CM)转移1小时,小片段在低电压下转移较好。然后升压至30V(4V/CM),再转移2小时,使大片段转移彻底。通过紫外光可检查转移效果。
6.3.4结束转移,取出尼龙膜,在电泳缓冲液中漂洗可能粘附的凝胶,浸泡膜于2×SSC中至少5分钟(5~30min)。
6.3.5紫外交联,在基因交联仪中进行,设定如下参数:
湿膜:150mj,13秒,C3
干膜:13秒,C2
如需重复杂交时,勿让膜干透。
7.cDNA的32P末端随机引物标记
7.1 变性25ngDNA(适当增大加入量)溶解在5~20μl 蒸馏水中,沸水浴加热5min,然后立即冰上制冷。
7.2 冰上进行以下操作:
2μl dATP
2μl dGTP
2μl dTTP
10μl 随机引物缓冲液(Random Primer Buffer)
3μl(约50μCi,[α-32P]dCTP,Mixture)3000Ci/mmol,10μCi/μl
加蒸馏水至总体积49μl,短暂振荡。
7.3 加入1μlKlenow片段,缓慢且完全混匀,短暂离心。
7.4 25℃温育1h。
7.5加入5μl终止液。直接用于杂交反应或放于-20℃以备使用,但不可放置太久。
附注:第4步中孵育时间大于1h可以产生较高的特异性。
第5为得到理想结果,超螺旋DNA应在随机引物标记前线粒化或碱变性。
8.杂交
8.1 室温浸泡膜于2×SSC中15分钟。倒掉液体,加入7.5ml预杂交液。65℃预杂交4h。
8.2 沸水浴200ng cDNA探针(于50μl缓冲液中)5~15分钟,然后立即在冰水混合物中致冷。离心。
8.3 倒掉预杂交液,加入10ml新鲜配置的杂交缓冲液,内含10%硫酸葡聚糖(dextran)以及32P标记的探针(每次10ml杂交液中加入5μl 32P标记探针)。垂直放入杂交管底部,摇匀。65℃,在杂交炉中转动杂交25(>16)小时。
8.4 自然冷却至室温,洗膜30分钟(杂交炉中转动),洗膜液Ⅰ为1×SSC,0.1%SDS。
8.5 60℃,洗膜液Ⅱ中洗膜3×30分钟(杂交炉中转动)。
9.放射自显影
吸干多余的液体,包上可透过紫外线的塑料保鲜膜,在暗室中将杂交膜和X光片放入增感屏内,密封后放在-80℃中,48小时。
10.显影和定影
暗室中显影13分钟,定影30分钟。
11.洗掉探针
用50mL洗膜液Ⅲ于65℃,2×30分钟。用2×SSC室温漂洗5min×2。
Northern Blot 实验过程中所用到的试剂配方:
―――――杂交前――――
1.5×MOPS,500ml
0.1M MOPS
0.04M NaAc
0.005M EDTA
在400mL的DEPC水中溶解11.56g MOPS,用HAc或NaOH调节PH至7.0,然后加入2.72g NaAc及5mL 0.5M EDTA,用DEPC水定容至500mL,用0.22μm的滤膜过滤除菌,避光保存。
2.0.5M EDTA(PH8.0),50 mL
EDTA 7.306g
DEPC水 45mL
用NaOH调至PH8.0,补加DEPC水到50 mL
3.甲醛凝胶上样缓冲液(约20μL,即 loading buffer)
50% 甘油
1mM EDTA(PH8.0)
0.25% 溴酚蓝
0.25% 二甲苯青FF
4.1×MOPS,500mL
5×MOPS 100mL
DEPC水 400mL
5.20×SSC,1000mL
3M 175.3g NaCl
0.3M 88.2g 柠檬酸三钠・2H20(88g/L)
用1M HCL调PH7.0,定容到1000mL
6.2×SSC,500 mL
20×SSC 50mL
DEPC水 450 mL
7.5×TBE ,400mL
21.6克 Tris碱
11.0克 硼酸
8mL 0.5M EDTA PH8.0
加DEPC水至400mL,出现沉淀后废弃。
8.1×TBE,1000mL
10×TBE 100mL
DEPC水 900mL
――――――杂交时―――――
1.2×SSC
2.预杂交液,50mL
DEPC水 30mL
SDS 3.5g
Na2HPO4・12H2O 2.45g
NaH2PO4(NaH2PO4・2H2O) 0.38g(0.494g)
0.5M EDTA 100μL
BSA 0.5g
去离子甲酰胺 7.5mL
加无离子水至50mL
――――――杂交后――――――
1.洗膜液Ⅰ,500mL
1×SSC 500mL
0.1%SDS 0.5g
2.洗膜液Ⅱ,2000mL(500mL)
NaH2PO4・2H2O 2.465g (0.62g) 25mM
Na2HPO4・12H2O 12.248g (3.06g) 25mM
EDTA 0.584g (0.146g) 1mM
SDS 20g (5g) 1%
加水至 2000mL (500mL)
3.洗膜液Ⅲ,500mL
Na2HPO4・12H2O(10mM) 1.79g
DW to 250mL
约1mL磷酸调PH7.0
去离子甲酰胺(50%) 250mL