特殊组织DNA的提取及鉴定

1、提取DNA的简易方法:
1)、从全血中提取DNA：取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍 有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。
2)、从其它有核细胞中提取DNA：可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。
2、从全血中用有机溶剂提取DNA：
1）试剂
a.10%SDS
b.2.0M醋酸钠
c.20mg/ml蛋白酶K
d.苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)
e.分析纯乙醇
f.TE(10mM Tris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5)
2）步骤
A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。
B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。
C、吸取1.0ml上清液并弃去。
D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。
E、向沉淀中加入：375μl 2M醋酸钠; 25μl 10%SDS;5μl 蛋白酶K溶液。略加振荡，于56℃保温一小时。
F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。
G、12000rpm离心5分钟。
H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。
I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置10分钟以上。
J、12000rpm离心10分钟。
K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。
L、加180μl TE 后振荡。加20μl2M醋酸盐，手工混匀。
M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。
N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。
O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。或将管子放在100℃以下烘干。
P、加200μl TE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA 2小时以上），次日清晨振荡10秒。
3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA
1)试剂
a.斑痕抽提缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇， 2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0）
b.其它试剂见2.1)
2)步骤
A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。
B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液，混匀，离心数
秒使碎片浸入液体。
C、于56℃保温过夜。
D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。
E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。
F、将上清液转移到新的离心管。
G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。
H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。
I、12000rpm离心10分钟。
J、倾去酒精。
K、用1ml室温的70%酒精洗涤。
L、12000rpm离心5分钟。
M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。
N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干.
O、56℃下用36μl TE溶解DNA，时间至少2小时。
4、从精斑中分离提取DNA
1）试剂
a.TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升）
b.20%sarcosyl
c.0.39M二硫苏糖醇
d.其它试剂见2.1)
2)步骤
A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。
B、管中加入400μl TNE缓冲液；25μl 20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37保温2小时。
C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。
D、移上清液（内含裂解细胞或"雌性"片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子）。再用TNE洗脱沉淀物四次。
E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37℃保温2小时。
F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。
5、用Chelex从全血/血斑中抽提DNA
1）试剂
a.TE
b. 5%Chelex 100(w/v于无菌水中)
2）步骤
A、3μl全血或3mm×3mm的血斑置于灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌的1mlTE于管中，振荡数秒。
B、置于室温30分钟，振荡数秒。
C、用12000rpm离心3分钟。
D、弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。
E、加入200μl 5%Chelex，振荡数秒。
F、于56℃保温30分钟。
G、振荡数秒。
H、沸水浴8分钟。
I、振荡数秒。
J、用12000rpm离心5分钟，上清中为提取的DNA。
6、用Chelex从精斑中抽提DNA
1）试剂
a.TE
b.10mg/ml蛋白酶K
c.20% Chelex100（w/v于无菌水中）
d.洗脱缓冲液(10mM Tris,10mM EDTA,50mMNaCl,2%SDS,Ph7.5)
e.1M二硫苏糖醇
2）步骤
A、将附有检材的棉签或纤维置于1.5ml灭菌离心管中，加1ml灭菌的TE，振荡数秒。
B、室温30分钟。
C、振荡数秒。
D、用一新的灭菌牙签将残片拧干后从管中取出。
E、用12000rpm离心3分钟。
F、弃去上清液，但保留约50μl上清液，勿使"细胞沉淀"搅起（若沉淀体积较大，应保留更多上清液，在此例中，保留的上清液体积应为沉淀的2倍）。
G、加150μl灭菌的蒸馏去离子水和2μl蛋白酶K溶液。
H、56℃保温1小时以裂解非精子细胞。
I、用12000rpm离心5分钟，沉淀为"精子沉淀"。
J、取150μl上清液（含裂解细胞组分）及到一新的1.5ml离心管中，再加50μl 20%Chelex，振荡数秒后，稍加离心，然后接步骤O～S进行操作。
K、用0.5ml洗脱缓冲液重新悬浮原管中的沉淀，略加振荡, 用12000rpm 离心5分钟，弃去约450μl上清液。
L、重复步骤K再洗四次。
M、用1ml灭菌的蒸馏去离子水重新悬浮沉淀，稍经振荡，用12000rpm离 心5分钟，弃去950μl上清液。
N、加150μl的5%Chelex，2μl蛋白酶K溶液，7μl 1M的二硫苏糖醇 于"精子组分"，振荡数后，稍加离心。
O、56℃保温1小时。
P、振荡各管数秒。
Q、样品于沸水浴8分钟。
R、振荡数秒。
S、用12000rpm离心3分钟，两管的上清中分别含有非精子细胞DNA和精 子细胞DNA。
四、PCR扩增:
取一支离心管，加（反应管数+1）×（2μl 10×引物混合物+2μl 10×反应混合物+0.4μl HS-Taq（用前必须用手弹匀），混匀后，每个反应管分装4.4μl，然后,加提取的DNA2μl,再加13.6μl ddH2O和一滴石蜡油,（若模板DNA浓度太低,可适当增加其体积,但同时要减少ddH2O体积,以保持总反应体积为20μl）稍离心后按下列条件进行扩增：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒；63～56℃退火30秒（每循环一次降低一度）；72℃延伸1分钟，共循环30次。最后72℃保温10分钟。