PCR技术（五）：常见问题分析与对策

PCR产物的电泳检测时间

　　一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。 

假阴性，不出现扩增条带

　　PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板： ①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

　　酶失活 ：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。

　　引物： 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：① 选定一个好的引物合成单 位。② 引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变 ：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul 、30ul 、50ul 。或100ul ，应用多 大体积进行PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因： 变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性; 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。

　　靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。

假阳性

　　出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增 时，扩增出的PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决： ① 操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。② 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③ 必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

　　PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有： ① 必要时重新设计引 物。② 减低酶量或调换另一来源的酶。③ 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④ 适当提高退火温度或采用二温度点法(93 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸) 。

出现片状拖带或涂抹带

　　PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有： ① 减少酶量，或调换另一来源的酶。② 减少dNTP 的浓度。③ 适当降低Mg2+ 浓 度。④ 增加模板量，减少循环次数。