免疫细胞化学染色操作规程

一、材料和试剂
1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。
2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。
3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。
4、0.01M PH7.4 PBS
5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）
6、AEC底物
（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6
醋酸（分子量60.6） 30.6ml
Triton -100
醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克
加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml
（2）AEC（20X）
AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中）
（3）0.6% H2O2（20X）
临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。
7、DAB（即DAB-4HCL）
（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）
（2）1M Tris（20X），用HCL调PH到7.4
（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。
溶解后（可加热到500C），加水合氯醛 50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或40C保存。
8、苏木素复染液
苏木素 1克
碘酸钠 0.2克
钾矾 50克
水 1000ml
9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。
10、3%H2O2：30% H2O2 1份，加9份双蒸水，临用时配。
11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板（见ICC protocol 04）
12、封片液：1克明胶，溶于30ml 350C水中，加入35ml 甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。

二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）
1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或370C 10-15分钟，使恢复温度。
2、加3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。
3、室温10分钟后，甩掉H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。

三、封闭
细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。

四、免疫化学染色
1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜；
2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次；
3、加S.P试剂（S.P法，即放大法）
（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37℃温和孵育30分钟；
（2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干；
（3）加已优选好浓度的S.P试剂，用量同“（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干；
4、间接法加二抗（不放大法）
方法同S.P法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤；
5、加底物显色
（1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，细胞培养板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++” ），用自来水即可终止反应；
（2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。
6、封片
洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油―明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判断
KSHV 阳性――诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导BCBL-1阳性细胞（1-30%）
阴性――诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应）
MCMV/HVMV 阳性――感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异性染色）
阴性――感染细胞和未感染细胞不显红色
注意：
1、一抗、二抗的稀释采用1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS
2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）
3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）

六、说明
1、测血时一抗血清稀释度要求
项目 KSHV MVMV HCMV 其它
稀释度 1:50，1:100,1:200 1:50，1:100,1:200 1:100，1:500,1:1000 1:100，1:500,1:1000
可融合标准 1:100阳性时 1：100阳性 1：500阳性 1：500阳性

2、S.P法使用二抗的不同情况
项目 MCMV HCMV 其它
样品 母克隆、亚克隆细胞培养上清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清
一抗为IgG型，
Biotin标记二抗 Biotin-Anti mouse IgG F(ab`)2,SIGMA,CAT:B6774
一抗为IgM型，
Biotin标记二抗 Biotin-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT:62-6440
稀释度 1：200

3、间接法（不放大法）使用二抗的不同情况
项目 MCMV KSHV
样品 血清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清
一抗为IgG型，
HRP标记二抗 HRP-Anti mouse IgG Fc,1:100,SIGMA,CAT:A-0168
一抗为IgM型，
HRP标记二抗 HRP-Anti mouse POLYVALENT,1:100,SIGMA,CAT:A-0412
稀释度 1：100


4、对照系统，必须要做的对照系统如下：
阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清
阴性对照：
（1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液
（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照
空白对照：不加一抗，用1%BSA替代
无关对照：与本项目无的第一抗体