小鼠甲状腺过氧化物酶抗体(TPO Ab)试剂盒使用说明

互联网2013-09-06

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小鼠甲状腺过氧化物酶抗体(TPO Ab) 试剂盒使用说明

原理

本实验采用双抗体夹心 ELISA 法。用抗小鼠 TPO Ab 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 TPO Ab 与单抗结合，加入酶标抗体，形成免疫复合物连接在板上，加入酶底物TMB ，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在 4 50 nm 处测 OD 值，TPO Ab 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TPO Ab 浓度。

试剂盒组成（ 2-8 ℃保存）

酶标板（<font>Coated Wells</font> <font>）</font>	96 孔	酶标抗体稀释液（<font>Enzyme Conjugate</font> <font>）</font>	12ml
10<font>×标本稀释液（</font> <font>Sample Buffer</font> <font>）</font>	12ml	20<font>×浓缩洗涤液（</font> <font>Wash Buffer</font> <font>）</font>	50ml
标准品（<font>Standards</font> <font>）</font> ： 500ng	2 瓶	底物工作液（<font>TMB Solution</font> <font>）</font>	12ml
酶标抗体浓缩液<font>(100X)</font>	120ul	终止液（<font>Stop Solution</font> <font>）</font>	12ml

准备试剂与收集血样

1. 收集标本：血清、血浆（肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2-8 ℃ 保存48 小时；更长时间须冷冻（ -20 ℃或 -70 ℃ ）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作 1： 10 稀释（取 2 0ul，加 标本稀释液 18 0ul,稀释 10 倍）。

2. 标准品液配制：使用前加入0.5ml 蒸馏水 混匀，配成 1000n g/ml 的溶液。设标准管 8 管，每管加入标本稀释液 30 0ul 。在第一管中加入 1000n g/ml 的标准品溶液 3 00ul 混匀后用加样器吸出 3 00ul ，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 3 00ul 弃去。第八管为空白对照。

3. 10× 标本稀释液用蒸馏水作 1: 1 0 倍稀释（示例： 1ml浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。

4. 酶标抗体浓缩液用酶标抗体稀释液作 1: 1 0 0 倍稀释（示例： 10ul浓缩 液+9 90u l 稀释水）。

5. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例：1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）

检测程序

1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 12 0 分钟。

2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。。

3. 每孔加酶标抗体工作液100ul 。将反应板置 37 ℃ 6 0 分钟。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加入底物工作液100ul ，置 37 ℃ 暗处反应15 分钟。

6. 每孔加入100ul 终止液混匀。

7. 30分钟内用酶标仪在 45 0 nm 处测吸光值。

结果计算与判断

1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。

2. 以标准品500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.2 、 15.6 、 7.8 、 0 ng /ml 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 TPO Ab 含量，再乘上稀释倍数10 即可。

试剂盒性能

1. 灵敏度：最小的TPO Ab 检测浓度小于 4ng /ml。

2. 特异性：可同时检测重组或天然的小鼠 TPO Ab 。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。

3. 重复性：板内、板见变异系数均小于12％。

注意事项

1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2. 洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。

3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

4. 本试剂盒宜置 4 o C冰箱保存。

5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！