脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳

1 ）高分子量 DNA 琼脂糖凝胶块制备和加工

1． 收集 10ml 全血，加入 30ml 细胞裂解液。置冰浴中至少 20min 直至红细胞完全溶解。

2． 2000r/min 离心 10min ，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用 PBS 重悬细胞。

3． 稀释单细胞悬液并取一小份用 Neubauer 腔计数细胞。

4． 用 PBS 重悬细胞，以达到 40 μ l PBS 中含 1 百万个细胞比例（ 1 百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组 DNA 10 μ g ）

5． 用 PBS 配制 2 ％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在 50 ℃。

6． 将等体积（各 1ml ）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7． 静置 20min 让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入 2mg/ml 的蛋白酶 K 。

8． 将带有凝胶块的蛋白酶 K 缓冲液于 50 ℃保持 2 ～ 3 天。每个盛有 50ml 蛋白酶缓冲液的 Falcon 管可容纳多达 100 个凝胶块。

9． 蛋白酶 K 消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或 0.5mol/L EDTA 溶液中保存于 4 ℃。

10． 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的 TE 缓冲液冲洗数遍的步骤。

11． 将凝胶块放入装有 TE 及 0.04mg/ml PMSF 溶液的 Falcon 试管中，灭活残留的蛋白酶 K 。

12． 室温下用 TE 溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用 0.5mol/L EDTA ，（ pH8.0 ） 4 ℃保存凝胶块。

13． 若用 EDTA 保存凝胶块，取出后应用 TE 溶液室温下漂洗 30 min × 2 次。

2 ）大小标准物的制备

l λ多联体

1． 以 TE 缓冲液悬浮λ多联体（ Boehringer MA 宝灵曼公司产品），浓度为 4 μ g/40 μ l 。

2． 用等体积 TE 配制的 2 ％低熔点琼脂糖（温度保持在 45 ℃）混匀。

3． 移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4． 室温下用 TE 及 100 mmol/L NaCl 溶液温育 2 天。

l 酵母染色体

1． 从 YPD （酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入 10ml YPD 预培养的肉汤中， 30 ℃下剧烈震荡生长 24 小时，然后加入 200ml YPD 肉汤，剧烈振荡 24 ～ 48h （产量大约 100 块）。

2． 4000 × g 转速，离心 10min ，然后用 50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 溶液悬浮。

3． 仍以 4000 × g 转速离心 10min ，再用 SCE[1 mol/L 山梨醇， 0.1mol/L 枸椽酸钠， pH5.8 及 10 mmol/L EDTA (pH7.5)] 溶液重悬。

4． 取稀释后的细胞悬液用 Neubauer 腔计数。

5． 溶液短暂离心后，再用 SCE 重悬细胞，使 40 μ l SCE 溶液中含 5 × 10⁷ 个细胞（相当于 80 μ l 体积的模块中含有 5 × 10⁷ 个细胞）。

6． 溶液与 0.1mg/ml 酵母扣糖酶 100T 和 100mmol/L β - 巯基乙醇混匀， 37 ℃保温 15 ～ 30min 。

7． 细胞悬液与等体积的 SCE 配制的 2 ％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在 50 ℃。

8． 将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9． 凝胶块用含 10 mmol/L 二硫苏糖醇的 SCE 溶液 37 ℃下振荡温育 1 ～ 2 小时。

10． 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入 2mg/ml 蛋白酶 K ， 50 ℃温育 48h 。

11． 用 50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 溶液洗涤凝胶块 3 次，每次 20min 。

12． 凝胶块可用此混合液于 4 ℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。

3 ）琼脂糖凝胶块中 DNA 的限制性内切酶消化

1． 应使用消毒溶液及戴无菌手套以免 DNA 降解。

2． 在 Falcon 试管中用 1 × TE 溶液漂洗凝胶块 20min 3 次，以去除 EDTA 。

3． 混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液）， 100 mmol/L 亚精胺（只用于高盐缓冲液状态）， 10 ～ 20 单位的内切酶。 20 单位的内切酶就足以过夜完全消化 10 μ g DNA 。

4． 设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性 DNA 降解。

5． 将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6． 若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求 50 ℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。

7． 若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用 1 ： 10 稀释的酶进行尝试。

4 ）凝胶电泳

1． 将 0.8 ％的琼脂糖在 0.25 × TBE 中熔化后冷却至 50 ～ 60 ℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。

2． 凝胶固化后小心地拔出齿梳，用 2 把无菌手术刀将 DNA 凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将 DNA 大小标志物上样至凝胶的两旁。

3． 用 1 ％液态低熔点琼脂糖凝胶（ 0.25 × TBE 配制）密封狭槽。

4． 若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。

5． 一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约 10min ），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6． 应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》 84 页表 8.1 ）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。

7． 电泳结束后，凝胶用 0.25 × TBE 配制成的 EB （ 0.4 μ g/ml ）染色。

8． 用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。

9． 凝胶成像： DNA 在曝光的过程中可能会形成缺口。

10． 用 0.25mol/L HCl 漂洗凝胶 30min ，让 DNA 脱嘌呤，并有利于转移。

11． 凝胶用碱（变性溶液中）变性 20min ，两次，续以中性溶液 1 ～ 5min 。

12． 采用标准 Southern 印迹方案将 DNA 转印至尼龙膜上。一般来说，印迹 PFGE 凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约 48h ）。