原理
PFGE 用于分离很大的 DNA 分子,因而需要很高分子质量的标准。这种标准可以按照 Lauer 等(1977 ) 介绍的方法从噬菌体,如 T7 (40kb)、T2 (166kb)和 G (758kb) 提取获得。但是一个更好的覆盖范围更广的系列标准是 λ 噬菌体 DNA 的系列串联体。后面介绍的具体步骤是 Vdlrath 和 Davis (1987) 方法的改进。
材料与仪器
噬菌体 T4 DNA 连接酶 纯化的噬菌体 λDNA
ATP Dithiothreitol EDTA 连接缓冲液 低熔点琼脂糖缓冲液 聚乙二醇 TE
低熔点(LMT ) 琼脂糖 Tygon 管 水浴
ATP Dithiothreitol EDTA 连接缓冲液 低熔点琼脂糖缓冲液 聚乙二醇 TE
低熔点(LMT ) 琼脂糖 Tygon 管 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 0.1 mol/L)
Dithiothreitol ( 1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)
含聚乙二醇的 1X 连接缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH7.6),1 mmol/L ATP,10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),10 mmol/L MgCl2,2% PEG 8000)
低熔点琼脂糖缓冲液(100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6),20 mmol/L MgCl2)
MgCl2 ( 20 mmol/L)
聚乙二醇(8%, m/V,PEG 8000 溶液)
TE (pH7.6)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
3. 凝胶
低熔点(LMT ) 琼脂糖
4. 核酸和寡核苷酸
纯化的噬菌体 λDNA
5. 专用设备
Tygon 管
56℃ 水浴
二、方法
1. 在 10 ml LMT 缓冲液中通过沸水浴或微波加热溶解 0.1 g 低熔点琼脂糖。冷却到 37℃。
2. 在 172.5 μl TE (pH 7.6) 中溶解 10 μg 纯化的噬菌体 λDNA, 加热该溶液至 56℃ 5 min。
3. 冷却溶液到 37℃,迅速按顺序加入下述试剂:
8%PEG8000 62.5 μl
20 mmol/L MgCl2 5.0 μl
0.1 mol/L ATP 5.0 μl
1 mol/L DTT 5.0 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 0.5 Weiss 单位
1% LMT 琼脂糖溶液 250 μl
聚乙二醇起集聚剂的作用,增加连接效率。
4. 混合物吸入一个稍短的 Tygon 管,在冰上冷却至琼脂糖完全凝结。
5. 将凝胶栓移入一个无菌的一次性塑料管内,其中有 3 倍体积的含聚乙二醇的1x 连接缓冲液。
6. 凝胶栓在连接缓冲液内室温温育 24 h, 然后转移到 10 倍体积 20 mmol/L EDTA ( pH 8.0)的试管内。
7. 在 EDTA 中温育 1 h, 再将凝胶栓转移到新鲜 10 倍体积 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 的试管内。
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 0.1 mol/L)
Dithiothreitol ( 1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)
含聚乙二醇的 1X 连接缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH7.6),1 mmol/L ATP,10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),10 mmol/L MgCl2,2% PEG 8000)
低熔点琼脂糖缓冲液(100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6),20 mmol/L MgCl2)
MgCl2 ( 20 mmol/L)
聚乙二醇(8%, m/V,PEG 8000 溶液)
TE (pH7.6)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
3. 凝胶
低熔点(LMT ) 琼脂糖
4. 核酸和寡核苷酸
纯化的噬菌体 λDNA
5. 专用设备
Tygon 管
56℃ 水浴
二、方法
1. 在 10 ml LMT 缓冲液中通过沸水浴或微波加热溶解 0.1 g 低熔点琼脂糖。冷却到 37℃。
2. 在 172.5 μl TE (pH 7.6) 中溶解 10 μg 纯化的噬菌体 λDNA, 加热该溶液至 56℃ 5 min。
3. 冷却溶液到 37℃,迅速按顺序加入下述试剂:
8%PEG8000 62.5 μl
20 mmol/L MgCl2 5.0 μl
0.1 mol/L ATP 5.0 μl
1 mol/L DTT 5.0 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 0.5 Weiss 单位
1% LMT 琼脂糖溶液 250 μl
聚乙二醇起集聚剂的作用,增加连接效率。
4. 混合物吸入一个稍短的 Tygon 管,在冰上冷却至琼脂糖完全凝结。
5. 将凝胶栓移入一个无菌的一次性塑料管内,其中有 3 倍体积的含聚乙二醇的1x 连接缓冲液。
6. 凝胶栓在连接缓冲液内室温温育 24 h, 然后转移到 10 倍体积 20 mmol/L EDTA ( pH 8.0)的试管内。
7. 在 EDTA 中温育 1 h, 再将凝胶栓转移到新鲜 10 倍体积 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 的试管内。
来源:丁香实验