与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定
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迁移率变动分析法
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 组装电泳装置并洗净玻璃板。
2． 按下表配制 4 ％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按 / 双丙稀酰按（ 29 ： 1 ） 4ml
TBE （ 10 ×） 3ml
APS （ 10 ％） 200 μ l
TEMED 40 μ l
可灌制成 1 ～ 1.5mm 厚的凝胶。凝胶聚合约需 1 小时，使用前可于室温下保存 1 天。
l DNA －蛋白质结合反应
1． 将 10mg/ml 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 贮液用无菌双蒸馏水稀释成终浓度 6 μ g/ μ l 。将 6 μ g/ μ l 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 溶液与 32mmol/L （ pH8.0 ）的 EDTA 等体积混合，配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将 32 P 标记的 DNA 片段稀释至终浓度 2fmol/ μ l 。
2． 对于标准 DNA- 蛋白质结合反应，按下表顺序将下列试剂加入 1.5ml 微量离心管：
32 P- 标记 DNA 片段（ 2fmol/ μ l ） 0.5 μ l
poly(dI-dC) • poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液 0.5 μ l
核抽提液和 / 或透析缓冲液 9 μ l
总体积 10 μ l
吹吸混匀。
3． 室温温育 45 分钟，此时可将凝胶在 100V 预电泳 10 ～ 15 分钟。
4． 温育结束后，可不加染液直接将样品加在凝胶上。在一个小样孔中单独加入 10 μ l 含 0.05 ％二甲苯青和 0.05 ％溴酚蓝的透析缓冲液用来跟踪电泳进程。
5． 用 1 × TBE 缓冲液在约 10V/cm 条件下电泳约 2 小时。具体时间取决于所使用的 DNA 片段的大小。
6． 小心地把凝胶转移到 Whatman 3MM 滤纸上并用保鲜膜覆盖在凝胶上。 80 ℃用凝胶干燥器干燥凝胶约 1 小时。
7． 室温下把干燥凝胶对 X 光片曝光过夜。
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 组装电泳装置并洗净玻璃板。
2． 按下表配制 4 ％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按 / 双丙稀酰按（ 29 ： 1 ） 4ml
TBE （ 10 ×） 3ml
APS （ 10 ％） 200 μ l
TEMED 40 μ l
可灌制成 1 ～ 1.5mm 厚的凝胶。凝胶聚合约需 1 小时，使用前可于室温下保存 1 天。
l DNA －蛋白质结合反应
1． 将 10mg/ml 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 贮液用无菌双蒸馏水稀释成终浓度 6 μ g/ μ l 。将 6 μ g/ μ l 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 溶液与 32mmol/L （ pH8.0 ）的 EDTA 等体积混合，配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将 32 P 标记的 DNA 片段稀释至终浓度 2fmol/ μ l 。
2． 对于标准 DNA- 蛋白质结合反应，按下表顺序将下列试剂加入 1.5ml 微量离心管：
32 P- 标记 DNA 片段（ 2fmol/ μ l ） 0.5 μ l
poly(dI-dC) • poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液 0.5 μ l
核抽提液和 / 或透析缓冲液 9 μ l
总体积 10 μ l
吹吸混匀。
3． 室温温育 45 分钟，此时可将凝胶在 100V 预电泳 10 ～ 15 分钟。
4． 温育结束后，可不加染液直接将样品加在凝胶上。在一个小样孔中单独加入 10 μ l 含 0.05 ％二甲苯青和 0.05 ％溴酚蓝的透析缓冲液用来跟踪电泳进程。
5． 用 1 × TBE 缓冲液在约 10V/cm 条件下电泳约 2 小时。具体时间取决于所使用的 DNA 片段的大小。
6． 小心地把凝胶转移到 Whatman 3MM 滤纸上并用保鲜膜覆盖在凝胶上。 80 ℃用凝胶干燥器干燥凝胶约 1 小时。
7． 室温下把干燥凝胶对 X 光片曝光过夜。
DNase I 足迹分析法
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 组装制作测序胶所需装置并洗净玻璃板。
2． 按下表配制 4 ％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按 / 双丙稀酰按（ 38 ： 2 ） 11.3ml
尿素 31.5g
TBE （ 10 ×） 3.75ml
APS （ 10 ％） 300 μ l
TEMED 30 μ l
灌制凝胶。此凝胶聚合约需 2 小时。使用前可在室温下存放 1 天。
l DNA －蛋白质结合反应
1． 将 10mg/ml 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 贮液用水稀释成 6 μ g/ μ l ，等体积混合 6 μ g/ μ l poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 和 32mmol/L EDTA （ pH8.0 ），配制成 poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液。将 32 P 标记的 DNA 片段用片段重悬缓冲液稀释成 2fmol/ μ l 。
2． 对于标准结合反应，将以下试剂按下表顺序逐个加入 1.5ml 微量离心管：
32 P 标记 DNA 片段（ 2fmol ；通常约 20 000cpm ） 1 μ l
poly(dI-dC) • poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液 1 μ l
核抽提液和 / 或透析缓冲液 18 μ l
（含 20 ～ 50 μ g 蛋白质，具体用量取决于抽提物中 DNA 结合蛋白的活性）
总体积 20 μ l
吹吸混匀。
3． 室温温育 30 分钟。温育过程中，用 DNase I 稀释缓冲液稀释 DNase I 。（对于标准结合反应，稀释后的 DNase I 的浓度为 20 μ g/ml ）
4． 每管结合反应混合液中加 2 μ l 稀释的 DNase I 溶液，吹吸混匀（标准结合反应中， DNase I 的终浓度为 2 μ g/ml ）。室温温育 10 分钟，从第一次加样入结合反应混合液终起开始计时。
5． 加入 80 μ l DNase I 终止液和 100 μ l 酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）以终止酶解反应。
6． 振荡每管样品数秒，注意微量离心管管口应旋紧。室温离心 3 ～ 5 分钟。
7． 每管移取 85 μ l 上层水相至另一新管，将含酚相的离心管作为放射性废弃物丢弃。向每管水相中加入 200 μ l 95 ％乙醇，略作振荡后，将管置于碎干冰上放置 15 ～ 20 分钟。
8． 离心 20 分钟，小心弃上清。向每管沉淀加入 500 μ l 85 ％乙醇。离心 2 ～ 3 分钟，小心弃去上清，干燥沉淀。
9． 将沉淀在真空离心蒸发浓缩器中干燥约 5 分钟（确保沉淀干燥彻底）。每管中加入 3 μ l 甲酰按染液，用 Eppendorf 振荡器或涡旋混匀。
10． 煮样品 3 分钟后，立即置于冰上冷却。稍作离心，使样品汇集于管底，再放回冰上。上样于 6 ％测序胶，然后用 1 ×测序 TBE 缓冲液，在 45 ～ 50 ℃ 3000~4000V 下电泳，直至溴酚蓝走到凝胶底部。电泳过程中，为保持凝胶温度在 45 ～ 50 ℃ ，可能需要加大电压。
11． 甲醇 / 乙酸 /H2 O （ 5 ： 5 ： 90 ）固定凝胶 15 分钟后，将胶移至 Whatman 3MM 滤纸上用凝胶干燥器干燥。
12． 把干燥凝胶对 X 光片在－ 80 ℃曝光过夜，需使用增感屏。
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 组装制作测序胶所需装置并洗净玻璃板。
2． 按下表配制 4 ％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按 / 双丙稀酰按（ 38 ： 2 ） 11.3ml
尿素 31.5g
TBE （ 10 ×） 3.75ml
APS （ 10 ％） 300 μ l
TEMED 30 μ l
灌制凝胶。此凝胶聚合约需 2 小时。使用前可在室温下存放 1 天。
l DNA －蛋白质结合反应
1． 将 10mg/ml 的 poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 贮液用水稀释成 6 μ g/ μ l ，等体积混合 6 μ g/ μ l poly(dI-dC) • poly(dI-dC) 和 32mmol/L EDTA （ pH8.0 ），配制成 poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液。将 32 P 标记的 DNA 片段用片段重悬缓冲液稀释成 2fmol/ μ l 。
2． 对于标准结合反应，将以下试剂按下表顺序逐个加入 1.5ml 微量离心管：
32 P 标记 DNA 片段（ 2fmol ；通常约 20 000cpm ） 1 μ l
poly(dI-dC) • poly(dI-dC) ＋ EDTA 工作溶液 1 μ l
核抽提液和 / 或透析缓冲液 18 μ l
（含 20 ～ 50 μ g 蛋白质，具体用量取决于抽提物中 DNA 结合蛋白的活性）
总体积 20 μ l
吹吸混匀。
3． 室温温育 30 分钟。温育过程中，用 DNase I 稀释缓冲液稀释 DNase I 。（对于标准结合反应，稀释后的 DNase I 的浓度为 20 μ g/ml ）
4． 每管结合反应混合液中加 2 μ l 稀释的 DNase I 溶液，吹吸混匀（标准结合反应中， DNase I 的终浓度为 2 μ g/ml ）。室温温育 10 分钟，从第一次加样入结合反应混合液终起开始计时。
5． 加入 80 μ l DNase I 终止液和 100 μ l 酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）以终止酶解反应。
6． 振荡每管样品数秒，注意微量离心管管口应旋紧。室温离心 3 ～ 5 分钟。
7． 每管移取 85 μ l 上层水相至另一新管，将含酚相的离心管作为放射性废弃物丢弃。向每管水相中加入 200 μ l 95 ％乙醇，略作振荡后，将管置于碎干冰上放置 15 ～ 20 分钟。
8． 离心 20 分钟，小心弃上清。向每管沉淀加入 500 μ l 85 ％乙醇。离心 2 ～ 3 分钟，小心弃去上清，干燥沉淀。
9． 将沉淀在真空离心蒸发浓缩器中干燥约 5 分钟（确保沉淀干燥彻底）。每管中加入 3 μ l 甲酰按染液，用 Eppendorf 振荡器或涡旋混匀。
10． 煮样品 3 分钟后，立即置于冰上冷却。稍作离心，使样品汇集于管底，再放回冰上。上样于 6 ％测序胶，然后用 1 ×测序 TBE 缓冲液，在 45 ～ 50 ℃ 3000~4000V 下电泳，直至溴酚蓝走到凝胶底部。电泳过程中，为保持凝胶温度在 45 ～ 50 ℃ ，可能需要加大电压。
11． 甲醇 / 乙酸 /H2 O （ 5 ： 5 ： 90 ）固定凝胶 15 分钟后，将胶移至 Whatman 3MM 滤纸上用凝胶干燥器干燥。
12． 把干燥凝胶对 X 光片在－ 80 ℃曝光过夜，需使用增感屏。
