常用的分子生物学基本技术2

IS PCR的技术特点 （1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。 IS PCR的基本方法 IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。 初步应用 有关原位PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过PCR扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。有传统的标记探针的原位PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。 原位PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。 基因转染技术 将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。 基因运载系统 将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。 1.基因转移的非病毒方法 直接注射法 将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。 磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。 脂质体染法 指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。 受体介导的基因转移 依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选将DNA和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前影上还在一些问题。 显微注射法 在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。 电穿孔法 利用脉冲场将DNA导入培养细胞。 微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。 胚胎干细胞法 胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至4个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞，能在体外培养，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整合或基因剔险及基因及能。 精子载体法 最近发现用精子和NDA-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，可捕获得物物，大大间化了转基因动物的制备过程。 2.基因转移的病毒的方法 病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分；（2）在可能将有有制陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分 ，并能进分离；（4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。 逆转录病毒载体 逆转录病毒辣为RNA病毒，它们的基因组编码在一条单链RNA他妇上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所必需的其他顺序，包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMV和SV。 DNA病毒载体 主要有腺病毒相关病毒载体，腺端正毒载体，疱疹病毒载体。对DNA病毒载体的研究是当前基因基因治疗研究中的重点领域。 常用的基因转染技术 将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术： 靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。 靶基因质粒DNA的准备 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。 具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。 转基因动物的建立和应用 转基因动物是以实验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内，使其稳定整合和遗传给后代动物。它主要采用显微注射法、逆转录病毒载体感染法、精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法。 转基因动物模型的建立，推动了肿瘤在分子水平上的研究，它使人们认识到激活的原癌基因的异常表达及功能失常，是肿瘤发生的初阶段。将癌基因与特定细胞的调控序列连在一起，可使癌基因在特定细胞中表达，研究靶细胞对不同癌基因的易感性，阐明某一癌基因对特定细胞生长、分化及功能的影响；它还可以研究多种基因的协同作用，有助于对多步骤致癌机进行深和的探讨。 转基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，还可以通过使某一基因功能丢失（如用基因剔除技术）研究抑癌基因在肿瘤发一中的作用。另外，转基因小鼠对致癌原的测试，为肿瘤的预防，治疗及发现新的致癌物质都提供了有价值研究工具。