常用的分子生物学基本技术（二）

PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。

异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。

化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodiimide,CDI）,CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA的点突变。

等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。

DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR） 与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。Batt在1994年发展了一种更为简的方法，好微孔板夹心杂交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。

等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T时，这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。

RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。

染色体原位杂交（In situ hybridization of chromosome）染色体发现距今已有150多年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊断。肿瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象，可分为原发和继发两类。在肿瘤形成的生物学基础方面，原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关，肿瘤细胞中可以发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等；继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快，检测的精确率也不断提高，这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS法。

荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）创建于1986年。1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TSA系统（tyramide signal amplification）能将杂交信号再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-3Mb,如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全伸展并粘附在玻片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种标记系统， 在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。

Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色体特异α卫星DNA标记。其基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在DNA聚合酶作用下，当引物延伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。PRINS技术的优点是不需克隆基因作探针，且由于杂交反应在前，标记在后，故非特异怀背景低。缺点是信号弱，灵敏度低，为克服这一制眯，Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术（repeated PRINS）,重复进行PRINS反应，使信号号强度明显提高。基于FISH的原理，发展了多色原位经物标记（multicolor PRINS）,可测定二个以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特异性比FISH还高。

DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法（direct sequencing,DS）。DS法测序的模板主主要来源于PCR，应用不对称PCR（asymmetric PCR）和基因组扩增转录同步测序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使单链产物大大增加。近年来，PCR循环测序法的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行，大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术，但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析，仍进行经典的手工测序。

突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞，如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微解剖法（microdissection）可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段长度多态性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、双脱氧指纹图谱法（dideoxy finger printing,ddF）、错配接合蛋白质截短测试法（protein truncation test,PTT）等。对已知突变基因进行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸链接检测法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛细管电泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。

用毛细管电泳技术检测DNA点突变
作者 樊兴君　金由辛
(中国科学院上海生物化学研究所、分子生物学国家重点实验室，上海 200031)

　　毛细管电泳(CE)是90年代初发展起来的新技术，具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化的特点。后来又发展了激光诱导荧光检测器(LIF)，大大提高了分析灵敏度，对微量样品如单细胞分析等，具有很大的优势。
　　通常，利用CE技术可以在20min内分析完成几千个碱基的DNA片段。CE可以应用于DNA点突变的检测，目前在PCR基础上利用CE技术对DNA已知点突变及未知点突变的检测发展十分迅速。

1. 已知点突变的检测

1.1　扩增抗拒突变系统PCR(ARMS-PCR)和短串联重复PCR(STR-PCR)　　ARMS-PCR和STR-PCR在检测已知点突变中愈来愈受到重视，尤其是用来诊断特殊遗传疾病和癌症。两种分析方法都包括利用可以辨别单碱基突变(ARMS-PCR)或者具有简单序列的不同数量的重复片段(STR-PCR)的引物进行专一性基因片段PCR扩增。CGE和ESCE都可以分析在ARMS-PCR基因PCR扩增中的单碱基取代产物。选择合适的多组PCR引物对可以同时对多个突变位点进行分析，Donohoe等［1］利用多重ARMS-PCR扩增反应鉴定了阿朴脂蛋白E基因。对于杂合子样品，STR-PCR 有一定困难，这包括长等位基因低的扩增效率和PCR扩增受阻(如非转一性片段的扩增)，这两种情况都会引起低的扩增条带。传统凝胶电泳需要放射性标记来进行分析。利用ESCE方法，LIF检测器，在10min内对这种类型的PCR扩增产物4个碱基差别的DNA片段做到基线分离，体现了CE在这方面分析中的出色优势。高灵敏度的LIF和高分离度的CE可以提供一个取代传统凝胶电泳的一个有效工具。
1.2　连接酶链式反应(LCR)　　LCR是一种点突变检测反应接着进行信号扩增的技术。在基因突变诱发人体疾病的程序性分析中十分有用。LCR反应中采用了两对互补寡核苷酸引物，如果引物的序列与目标序列能完全配对时，那么两对引物将与各自目标片段杂交，并连接；如果点突变出现在目标片段上时，将不能进行连接反应，就不会出现连接产物。Grossman等［2］利用ESCE快速分析了用于诊断膀胱纤维变性疾病的LCR产物，该方法也诊断了leber's遗传性光纤神经疾病。利用CE分析的时间大约是传统凝胶电泳的十分之一。用灵敏的LIF检测器可以做微量LCR分析，同样可以应用于分析那些紫外光可损DNA的分析。
1.3　等位基因特异性扩增分析(ASA)　　ASA是一种点突变的检测方法，两种寡核苷酸引物被用在PCR反应中。如果引物的序列与目标等位基因序列完全配对，那么引物在目标片段上杂交并变成PCR扩增；如果点突变发生在目标片段上时，则无扩增产物出现。单道及多道的CGE已经用于快速提供ASA基因图谱的分析工作。Barta等［3］利用CGE及LIF检测器分析了多重ASA反应，对先天性肾上腺增生患者21-hydroxylase基因的多个突变位点进行检测。将多重PCR定量扩增同CE连接将提高分辨率和速度，优越于任何现在使用的手段。
1.4　限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)　　PCR-RFLP是一种广泛用于检测已知DNA点突变的方法，它可以检测大到几千个碱基对DNA片段。该方法通过分析核酸限制性内切酶切割经目标模板PCR扩增的DNA片段上突变基因位点的有效性来分析DNA点突变。PCR-RFLP的分析可以利用CGE或ESCE，可以利用UV检测或LIF检测。ESCE被用在PCR-RFLP中检测病毒种系及分析通常在大量癌症病人和许多白血病衍生型病人中的K-ras locus DNA片段的基因突变位点［4］，CE在分析过程中远优于传统的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2. 检测未知点突变

2.1　定量反转录PCR　　在疾病状况下，特殊基因的突变活性影响病理的表现状态。定量反转录PCR(QRT-PCR)可以通过从mRNA合成的cDNA接着PCR定量扩增cDNA来估测基因的活性和表达。特征cDNA产物通常用凝胶电泳检测，定量方法或采用放射性同位素标记，或采用灰度扫描来完成。虽然自动DNA测序仪已被应用于QRT-PCR分析，但原位检测、峰面积定量和自动数据处理等CE技术可以提供直接RNA-PCR反应技术［5］，而RNA-PCR反映了体内基因表达情况。重要的是，利用UV定量要比间接依靠扫描方法更为准确。
2.2　异源双链核酸分子多态性分析(HPA)　　HPA广泛用于检测未知点突变。这种技术包括等位基因DNA片段变性(PCR-扩增)和接下来单链DNA分子重新退火形成一个原生型和突变型的双链DNA(dsDNA)片段混合物。这个组成是一个重聚的同源双链核酸分子(dsDNA)和新的异源双链核酸分子(dsDNA)的混合物。异源双链核酸分子出现的错配现象归因于结构的变化。在电泳过程中，异源双链核酸分子滞后于同源双链核酸分子。HPA依赖于DNA复制中局部结构的变化，随着DNA片段长度和围绕配对区域GC含量的增加，灵敏度会降低。
　　HPA已被成功地用ESCE进行分析，这种方法可以从同源双链核酸分子片段中分辨出异源双链核酸分子片段，其仅有一个碱基对错配［6］。它可以用于快速检测DNA突变而不需要进行DNA测序。通常传统的分析方法受焦耳热效应影响，要想将片段完全分离，整个分析过程大约需要4个小时，而CE技术却可以在数分钟内完成。
2.3　单链构象多态性(SSCP)　　SSCP也是一种分析未知点突变常用的方法。它包括双链DNA片段的解离，每两个单链片段依靠其特定序列组成一种折叠构象。SSCP分析的灵敏度依赖于是否突变影响到DNA的折叠和因此形成的单链DNA(ssDNA)分子在电泳中的移动速度。Atha等［7］利用ESCE结合SSCP分析了多组骨髓瘤患者P53肿瘤抑制基因372bpPCR产物的点突变。利用CE柱后多重荧光标记方法(一次分析检测多波长荧光)，可以一次对多组突变位点进行准确分析。突变DNA具有相似的电泳迁移性，但不同的荧光探针可以以其不同的信号加以区分。即使利用先进的高效多道聚丙烯酰胺测序技术，分析也往往需要9个多小时，用CE技术则可以在11～25min内完成。多道CE分析可以将许多不同样品在同样短的时间内(<1h)完成分析，效率更高。
2.4　化学裂解错配分析(CMC)和酶裂解错配分析(EMC)　　CMC和EMC都是检测未知点突变的比较新的方法。这两种方法都是提供主要的碱基错配区，PCR粗产物可以直接用这两种方法进行分析。通常，低吸收值的酶切产物需要放射性同位素标记PAGE分析，而CE则可以利用荧光标记的手段进行高灵敏度分析。Siles等［8］利用ESCE及LIF检测器对EMC反应的异热信号和PCR信号扩增两种方法产生DNA片段进行分析，以此来鉴定碱基错配位区。
2.5　变性梯度毛细管电泳(CDCE)　　CDCE是一种在变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法上发展起来，对未知点突变进行分析的技术。被分析的dsDNA必须包括两个差异区(domain)：一个50个碱基长度或G-C碱基对比例大的高熔温度区和一个包括异源双链核酸分子DNA错配对的低熔温度区域。在DGGE过程中，异源双链核酸分子进入包含一种或多种变性剂的梯度胶中，异源双链DNA分子链的裂解就会在错配位点开始并快速向低熔区扩张，这样就会极大地降低该分子在胶中的迁移速度。虽然DGGE对于突变点的检测率还不清楚，理论上可以达到100%。
　　用固定浓度的变性剂(脲或甲酰胺)连同分离时可以升到的恒定温度，或在分离过程中采用微机控制温度不断升高的方法(温度程序)，CDCE已经达到对一个错配碱基片段的分离。这些方法对于单碱基错配分析非常灵敏，但最直接的应用可能性决定于序列的组成，也就是说，是否有一个富含G-C区。很显然，一旦有一个G-C堆积(一个PCR引物的5′末端具有GC重复区)可以与PCR扩增产物或限制性片段相容，那么，出现的任何错配都可以容易地被CDCE检测。Cecilia等［9］利用ESCE技术检测了exon 17b(R10066H、R1066C、F1052V)基因片段上的三个点突变位点和exon 14a(v868v、t854t)上的两种形态；Muniappan等建立了利用温度程序对人体基因突变进行分析的方法。
2.6　双脱氧指纹分析(ddF)　　ddF是一种结合SSCP和Sanger双脱氧测序法检测未知点突变的方法，理论上可以检测所有类型的未知点突变。在ddF方法中，Sanger测序反应完成与一个双脱氧终止子(terminator)的反应产物通过非变性凝胶电泳来分析，通过分析获得或失掉一个双脱氧终止片段(双脱氧组成的)和/或至少一种包含点突变的DNA片段(SSCP组成)的电泳移动性的转变来判断点突变。Felmlee等［10］利用非变性CGE技术，用ddF方法检测了M.Tuber-culosis特异性扩增DNA片段单个点突变，对于单个样品，CE可以在25min内完成。一个对比实验表明，单柱CGE分析30个样品用时15h，而用传统聚丙烯酰胺凝胶电泳则需要36h。
　　CE是一个新发展起来的技术，它用于DNA点突变的检测是近年兴起的并迅速发展着的一个研究领域。它用于DNA点突变检测仍具有很大的潜力，如Khrapko及其合作者最近报道的用CE杂交技术检测DNA点突变，Piggee等报道的用单链寡核苷酸引物延伸及荧光标记方法检测DNA点突变等［11］。要详细了解CE检测DNA点突变技术，可以参考Le等的综述［12］。随着CE自身分析技术的不断改进和自动化程度的不断提高，如自动样品采集、制备、分析和数据处理，微柱快速分析的出现等，DNA点突变分析有望建立高准确度、高自动化的程序性分析方法。而程序性DNA点突变检测在临床诊断中具有十分重要的意义，也将会对生物化学及分子生物学等相关领域产生深远的影响。■

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