SNP实验标准操作规程

 

一、原理

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。

二、样品准备

1. DNA抽提

①    1、取新鲜肌肉组织约100mg，PBS漂洗干净，置于1.5ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。

②    加200μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混匀

③    加220μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。加220μl 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

④    将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。

⑥    加入700μl 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12000rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。

⑦    将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100μl 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12000rpm 离心30 秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲液50μl 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12000rpm 离心30 秒。

⑧    采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度，在OD260 处有显著吸收峰。同时检测纯度，OD260/280 的值应为为1.7-1.9。

⑨    从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液置于-20℃保存。

2. PCR扩增目的片段

按相关的试剂说明在标准反应管中准备反应体系，典型的PCR反应体系如下（20ul体系）：

10×Buffer	2ul
Taq酶	1ul
dNTP	0.5ul
上游引物	0.5ul
下游引物	0.5ul
无菌水	14.5ul
DNA模板	1ul

向左扳动仪器盖子上的手柄，揭开仪器盖子，小心放置样品管于仪器的相应样品孔中，轻轻盖上盖子，将顶部的旋钮慢慢旋紧，让热盖紧密接触样品管，样品放置完毕。

3. 在T1型PCR仪上编辑一个程序

按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。

输入程序中要求的温度：用[D enter]确认温度。为其输入时间，用小数点来间隔。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置，或者用光标键移动到下一个区域。＃表示循环的次数。设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完整的程序。程序数据永久的储存在记忆中。

4. 运行程序

按[B start/stop]选择一个程序。用→↑↓键选择一个子目录，或者用[D enter]进入主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者，按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用强光突出的程序。按[D start]启动程序。

5. 控制测试过程

运行过程中，按A按钮，可以获得程序剩余的时间信息。运行完成后，按STOP按钮终止实验，按YES确认终止。小心旋开热盖，按照放置样品的操作顺序，打开盖子，取出实验样品，再盖上盖子，关闭电源，本次实验结束。

6. PCR产物测序

由专门负责测序的服务公司完成

7. 数据分析

少量可人工读取，大量可软件读取。比对发现的SNP在基因组中的位置：重点是启动子区、外显子区域（包括编码区的cSNP及5’及3’UTR）、剪切边界等，密码子的改变是否导致氨基酸的改变：错义突变、无义突变、终止突变。

8. 注意事项

①  为保证待测目的区域测序真实可靠，引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50bp；

② 引物设计建议使用在线方式，以保证成功率；

③ 为保证测序敏感性，PCR产物片段大小应在250bp－650bp范围；

④ 为方便实验，建议引物合成时分装成1 o.d/管，方便将PCR与测序的引物分开；

⑤ 为保证引物的特异性，建议引物设计后在NCBI上blast确认；

⑥ 为防止降解，PCR产物应尽快测序，否则应该保存在-20℃，且时间不宜过长；

⑦ 为保证结果真实性，建议对关键点进行反向测序确认。