细胞生物基本方法：常用转化细胞

几种常用转化细胞和转化技术

 

1 ）致癌化学物转化细胞：转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验

1． 取材：妊娠后第 13 天取材，取数个同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用 0.25 ％胰蛋白酶（含 0.01 ％ EDTA ） 37 ℃消化 30 分钟，滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入 75cm/ 培养瓶中，接种密度 10 ～ 20 × 10⁶ /75cm ， 37 ℃培养 2 ～ 3 天，在顺利情况下能迅速长满瓶面。

2． 贮存：选大批生长状态良好的细胞冻存，储以备用。

3． 致癌物处理：取冻存细胞，解冻，接种于 25ml 培养瓶中，每瓶含细胞 10 万～ 30 万。待细胞生长进入指数增生期时，向培养瓶中加入致癌剂 MNNG 。致癌剂量 1 ～ 3 微克 / 毫升营养液。在 37 ℃温箱中培养 12 ～ 48 小时。

4． 低血清培养：弃掉 MNNG 作用液，用温 PBS 洗 1 ～ 3 次，加入含 20 ％小牛血清，继续置温箱中培养 2 ～ 3 周，然后改用含 5 ％血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞生长，但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶。

5． 转化灶形成和分离：在成功情况下，用致癌物处理过的细胞于 10 天后在正常细胞之间，可产生数量不等的转化灶。

 

 

2 ）病毒转化细胞

1． 血液制备：柠檬酸（ Citric Acide ）或肝素抗凝取血 1 ～ 2ml ，分装入管中，每管 0.5ml 全血，置于 4 ℃冰箱中 30 分钟。

2． EBV 病毒转化：从液氮中取出冻存的 0.5ml 全血，在 37 ℃水中迅速解冻。

3． 将解冻细胞与 10ml 不含血清的 RPMI 1640 混合， 2500 rpm 离心 2 分钟，弃上清，用含 20 ％的胎牛血清、青、链霉素和庆大霉素的 RPMI 1640 生长培养基重悬细胞。

4． 加入 0.3 ～ 0.5ml 的 EBV 病毒液， 37 ℃水浴 30 分钟～ 2 小时，并不时摇动，以免出现凝块。

5． 分装入 50ml 的培养瓶中，同时补加适量培养液，置入含 5 ％ CO₂ 温箱中， 100 ％温度下培养。

6． 一周后加补入 2ml 培养基。

7． 经常镜检培养物，每 3 ～ 4 天加液或换液，随细胞数量增多，可分装入大瓶中培养。

 

 

3）  癌基因转化细胞：基因组 DNA 转染法

1． 提取基因 DNA （含癌基因）。

2． DNA 准备：取供体 DNA50 ～ 100 微克，加 3M NaCl 或醋酸钠使最终浓度至 0.3M 混匀。

3． 再加 2 倍体积无水乙醇， 3000 转 / 分离心 10 分钟，去上清。

4． 加入转染缓冲液，待 DNA 充分融解后，再加入 2.5M CaCl₂ ，令最终浓度为 125mM ，用吸管轻轻吹打三次。置室温下 10 ～ 30 分钟，待液体透明度降低，出现微浊蓝色时，即可用于转染受体细胞。

5． 细胞：取生长状态良好、处于半汇合阶段的指数增生期细胞，在转染前 24 小时，更换培养液 1 次。

6． 转染：向每瓶中加 DNA －磷酸钙沉淀物 0.5 ～ 1ml/ 瓶，置 37 ℃作用 4 ～ 6 小时。

7． 培养：弃去培养液，用 15 ％甘油处理 3 分钟，无血清培养漂洗 1 次，加入新培养液， 37 ℃温箱培养 24 小时。

8． 传代：按 1 ： 5 或 1 ： 10 分瓶传代，每 2 ～ 3 天换液 1 次，接近汇合时血清用量降至 5 ％，培养 2 ～ 3 周。

9． 检测：逐日观察，待出现转化灶后，分离入另瓶中培养。