细胞的冷冻保存

1. 注意事项：

1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 � 90 ％致密度。

1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 ℃ 避光保存，勿作多次解冻。使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4. 冷冻保存之细胞浓度：

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些ybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Aden℃arcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymph℃yte须至少5 x 106 cells/ml

1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

1.6. 冷冻方法：

1.6.1.传统方法： 4℃ 10分钟--->-20℃ 30分钟---> -80℃ 16-18小时（或隔夜）--->液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以�1 ～ -3 ℃/分钟之速度由室温降至�120 ℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。

2. 材料

2.1. 生长良好之培养细胞

2.2. 新鲜培养基

2.3. DMSO (Sigma D-2650)

2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.6. 血球计数盘与盖玻片

2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)

3. 步骤：

3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10 ％，混合均匀，置于室温下待用。

3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 ℃ 10 分钟→ -20 ℃ 30 分钟→ -80 ℃ 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。

3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL