亲和色谱法

一、基本理论（一）原理　　在生物体内，许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。 2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。（二）应用范围亲和色谱可用于下列生物体系：酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。 （三）载体的选择原则　　　　 用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。　　选择也的配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。（四）常见载体的特性琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。 纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。 二、实验方法　　亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下： 1选 择 配 基；2选择偶联凝胶；3偶 联 配 基；4装填合适的柱；5平衡（2-3倍体积缓冲液）；6应 用 样 品；7洗涤未结合物质；8洗脱结合物质→除盐；9再生