水体中大肠菌群的检测步骤

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实验原理

所谓大肠菌群，是指在37℃培养 24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌 。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

水中大肠 菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。

材料与器皿

(—)培养基

1、普通乳糖蛋白胨培养液

蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。

2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。

1、 品红亚硫酸钠培养基(供平板分离用)

蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15～20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5%的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊红美蓝培养基(EMB培养基)(供发酵法平板分离用，3和4可任选一种)

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2%伊红(曙红)水溶液 20mL，5%美蓝(亚甲蓝)水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培养皿。

实验过程

(一)水样的采集

供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h ，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。

1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min ，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。

(二)初发酵试验

1、水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。

2、接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL， 小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。

3、结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。

若实验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。

(三)平板培养试验

将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培养物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基平板上，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：

(1)划线间距至少相隔0.5厘米;

(2)接种钉尖端要稍弯;

(3)先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣;

(4)划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面.以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于37℃培养18～24h。

24h后，观察在平板上出现的单个菌落，其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37℃培养24h。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在.

(四)复发酵验证实验

经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培养基的试管中，在37℃培养24h，阳性反应者即确认为大肠菌群细菌。

结果计算

在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观察，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管”)删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。

如果初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水样100mL中大肠菌群指数(MPN)。如果接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。

目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN×10。

水样的总大肠菌群检索表

出现阳性反应的试管数	每100ml中的细菌的MPN	出现阳性反应的试管数	每100ml中的细菌的MPN
10ml管	1ml管	0.1ml管	10ml管	1ml管	0.1ml管
0 0 0 0	0 0 0 0	0 1 2 3	0 2 4 5	0 0 0 0	2 2 2 2	0 1 2 3	4 6 7 9
0 0 0 0	1 1 1 1	0 1 2 3	2 4 6 7	0 0 0 0	3 3 3 3	0 1 2 3	6 7 9 11
0 0 0 0	4 4 4 4	0 1 2 3	8 9 11 13	1 1 1 1	3 3 3 3	0 1 2 3	8 10 12 13