真菌的DNA和RNA提取方法与操作步骤

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一、真菌 DNA的提取(方法一)

1.实验试剂

(1)DNA提取液：0.2M Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，0.01M EDTA，1%SDS

(2)3M NaAc

(3)TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)

(5)氯仿:异戊醇(24:1)

(6)异丙醇

(7)无水乙醇

(8)75%乙醇

(9)RNaseA

2.实验步骤

(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

(2)加入4mL提取液，快速振荡混匀

(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚，可以节约成本)

(4)1000rpm，4℃，5min

(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm，4℃离心5min)

(6)取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中

(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL)，37℃处理1h

(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)

(10)取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上

(11)沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用

二、真菌DNA的提取(方法二)

1.真菌菌丝0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉

2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min，期间混匀2-3次

3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min

4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)

5.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30 min

6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中

7.加入1ul RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h

8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)

9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上

10.沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用

DNA提取缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.5M NaCl，2% CTAB(W/V)，4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc

方法一和二，是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样!成本也不一样!