荧光原位杂交经验分享
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FISH的特点:操作烦琐,步骤简单。说它操作烦琐,是因为它的操作步骤烦多,每一步又需要相当长的时间,如果自己标探针的话每批标本大约三天时间(买试剂盒只需一天,但价格昂贵),你说是不是很烦琐?说它步骤简单也是有道理的。FISH其实并没什么神秘之处,只要操作过程仔细,严格按照操作步骤操作,很容易做成功,比PCR 要简单得多,所以说它是步骤简单。
但FISH有一些关键步骤是必需注意的,现就本人的理解说出来与大家分享。
(1)探针 的设计。设计探针要根据实验的需要来进行,也就是说你要检测的目的基因决定你的探针设计,如其他人说的“目的基因大概是1.8KB,所转材料是大豆”,我想你可以直接对你的PCR产物进行地高辛或生物素标记,如果探针较大,则可购买BAC或YAC等克隆进行探针标记。
(2)标本的预处理。标本的处理也关系到最后信号强弱的一个关键,但有些人不注意这些细节,结果造成荧光信号弱,难以分辨。这与预处理不当造成探针难以到达胞核而杂交 难以进行有关。
(3)变性。这一步是FISH关键中的关键。变性包括标本变性和探针变性,这两个步骤关系到FISH的成败,千万要严格按照操作规程进行,不但如此,特殊标本还要自己摸条件。试想变性不彻底,DNA的双链都没能完全打开,杂交能顺利进行吗?需要注意的就以上这三点,还要唠叨一句:操作荧光抗体时千万要避光,否则将前功尽弃。