苯酚法测定可溶性糖

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【原理】

植物 体内的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100μg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【仪器与用具】

分光光度计 ；电炉；铝锅；20ml刻度试管；刻度吸管5ml 1支，1ml 2支；记号笔；吸水纸适量。

【试剂】

1．90%苯酚溶液 称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月；

2．9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配现用；

3．浓硫酸（比重1.84）；

4．1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；

5．100μg/ml蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。

【方法】

1．标准曲线的制作

取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。

表24-1 各试管加溶液和水的量

管 号

0

1～2

3～4

5～6

7～8

9～10

100μg/ml蔗糖液(ml)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

水(ml)

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

蔗糖量(μg)

0

20

40

60

80

100

然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取

取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定 吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

可溶性糖含量(mg/g)=