转移电泳实验技术

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原理
转移电泳是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离出的蛋白质谱直接转移到硝酸纤维膜上，而形成固定相，并同时排除各种干扰物质，保持其天然构象和生物学活性，完成在凝胶中难以进行的各种生物试验。

材料
1．琼脂 糖
2．丙烯酰胺
3．甲叉双丙烯酰胺
4．十二烷基磺酸钠（SDS）
5．硝酸纤维膜滤纸 孔径0.45μm
6．琼脂糖凝胶电泳缓冲液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA （pH8.3）。
7．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1％SDS（pH8.3）。
8．蛋白质转移电泳缓冲液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20％甲醇（pH8.3）。
9．溴乙啶溶液 称取5mg溴乙啶，用无离子水溶解。定容到10ml，取1ml稀释到1 000ml，最终浓度为0.5ug/ml。 10．考马斯亮兰R－250染色液 0.25％考马斯亮兰R－250－10％醋酸－45％甲醇。
11．氨基黑染色液 在含10％醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至饱和。
12．垂直板型及水平板型凝胶电泳槽
13．转移电泳槽
14．直流稳压电源0V~800V，0mA~100mA

操作方法
1．SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳（垂直板型）分离蛋白质。
⑴凝胶的制备：
丙烯酰胺 15.00g
甲叉双丙烯酰胺 0.40g
0.37Mol/L Tris—HCl（pH8.3） 50ml
此为丙烯酰胺母液，过滤后4℃保存备用。
丙烯酰胺母液 8.30ml
N、N、N、N—四甲基乙二胺（DEMED） 250ul
10％SDS 0.25ml
0.375Mol/L pH8.8 Tris－HCl 16.45ml
混合即为10％分离胶。
丙烯酰胺母液 1.30ml
TEMED 15.00ul
10％SDS 0.10ml
0.125Mol/L pH6.8Tris－HCl 8.60ml
制成4％浓缩胶。
将分离胶与浓缩胶真空抽气10min~15min，备用。
⑵凝胶板的制备及加样：取1％的琼脂将凝胶膜底部的缝隙封固。在10％的分离胶中加入10％过硫酸铵0.25ml，混匀后，立即沿玻璃壁缓缓加入胶膜中，上端留出5cm的高度，然后用带有细针头的注射器轻轻地向胶面加入蒸馏水，静置数分钟，水胶界面消失，约20min～30min界面清晰（凝胶已聚合），用注射器将水吸出，并用滤纸吸干余水。在4％浓缩胶中加入10％过硫酸铵0.4ml，混匀后，沿玻璃壁缓慢倒入已聚合的分离胶的上面，立即插进样品槽模板。待凝胶聚合后（约20min～30min），轻轻拔出样品槽模板。将电泳缓冲液加入上、下电泳槽。
将分离的蛋白质样品用0.01Mol/L Tris－HCl（pH8.0）－0.001Mol/L EDTA－1％SDS－5％硫基乙醇溶液作1︰1稀释，100℃加热处理3min之后，加入甘油10％及适当量溴酚兰，用微量注射器将样品注入样品槽中，蛋白质最后浓度一般为0.05mg／ml～1mg／ml。
⑶电泳：上端接阴极，下端接阳极。电压120V、电流30mA，电泳时间5h~6h，待染料泳至距底部约1cm处时断电。
⑷染色：切下一部分凝胶，用考马斯亮兰R－250染色作为对照。其余部分作转移电泳。