等温滴定微量热技术在抗体性质研究以及质量控制中的应用

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介 绍
抗体和抗体产品在很多商业化产品中扮演了重要角色，如生物医药、诊断试剂盒以及色谱介质等。这些产品的质量控制对生物医药企业以及诊断试剂公司来说是至关重要的。通常用于检测抗体产品质量的方法有电泳和色谱法，它们能提供结构信息但不能提供结合活性的信息。例如无法给出不同批次间抗体产品活力的差别。等温滴定微量热技术(ITC)提供了一种非常简单而且准确的方法用于抗体的质量控制以及抗体和抗体产品的性质分析。ITC可以快速有效地测定多种参数，例如抗体亲和力(Ka)、抗原 结合热(ΔH)以及抗原抗体的结合比（n）。抗体结构上的改变(例如片段化、部分变性以及偶联修饰)都会影响抗体的结合性能。另外，结合热可以用来指示抗原抗体在体内和体外的相互作用。

图1 典型的ITC抗体实验结果图
上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图

在ITC实验中，一个配体（如受体、抗体）分子 在恒温条件下滴定到另一个相互作用分子的溶液中，结合释放的热（ΔH）被实时记录下来。连续进行多次滴定，分子结合释放或吸收的热直接正比于结合的分子数量。当系统达到饱和的时候，只能观察到稀释热。将每次滴定产生的热效应与滴定和被滴定分子的摩尔比作图，可以得到一条结合曲线（图1）。MicroCal ITC能自动完成滴定、数据采集和分析，使整个实验过程非常简单。ITC进行一次滴定通常不到一小时即可完成。在这份应用指南中， ITC被用于奎纳定抗体和茶碱抗体与各自抗原结合的活力和亲和力测定。也被用于证明共价耦联奎纳定抗体对其活性有不利的影响。这种方法的准确性和重复性通过茶碱抗体与抗原的结合试验得到证实。

确定活性抗体的浓度
茶碱是一种低分子量的支气管扩张剂，被用于治疗哮喘（图2）。它的其它医学用途包括作为利尿剂和强心剂。抗体通常用于诊断试剂盒中。制备出好的试剂盒，知道所用抗体的活性非常关键。我们证实ITC可以在较宽的浓度范围内确定溶液中活性抗体的浓度。利用ITC测定了茶碱与五种不同浓度抗体IgG的结合。如图3，活性分子的浓度对根据280nm吸光值得到的总蛋白浓度作图。

图3 两种方法测得抗体浓度比较
实验在30℃进行，样品池的体积是1.3ml。抗茶碱IgG抗体配成五种不同浓度，从0.8mg/ml到1.2mg/ml，蛋白浓度通过OD280吸收确定。所有滴定实验过程中，注射器中茶碱的浓度均为160μM。每次滴定实验共滴18次，每次滴10μl，每两次滴定间隔3.5min。将ITC测得的抗体活性浓度对总蛋白浓度作图，并进行线性拟合。